張 聰，周常義，江 鋒，曾 磊，楊名平，蘇國(guó)成*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.廈門(mén)中集信檢測(cè)技術(shù)有限公司，福建 廈門(mén) 361100)

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥(Pyrethroid pesticides)是仿效天然除蟲(chóng)菊化學(xué)結(jié)構(gòu)合成的廣譜性殺蟲(chóng)劑，因具有高效、低毒、生物降解和觸殺作用強(qiáng)等特點(diǎn)，而得到了廣泛應(yīng)用[1]。近年來(lái)，我國(guó)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥中毒事件時(shí)有發(fā)生，在農(nóng)產(chǎn)品、食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象也比較突出[2-4]。該類(lèi)農(nóng)藥有蓄積性，對(duì)哺乳動(dòng)物具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性和遺傳毒性，對(duì)一些非靶生物如昆蟲(chóng)和水生生物也有毒害作用[5]，加之不合理的使用，其殘留會(huì)對(duì)人體健康造成影響，因此，加強(qiáng)動(dòng)物源性食品中擬除蟲(chóng)菊酯的檢測(cè)方法研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)研究多集中于果蔬[6]、茶葉[7-8]和水體[9]等樣品，且主要采用氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和高效液相色譜法(HPLC)，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性，而且對(duì)食品中擬除蟲(chóng)菊酯的分析很少采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。Z-Sep+是十八烷基硅烷基團(tuán)和二氧化鋯結(jié)合在同一個(gè)二氧化硅顆粒上[10]。作為兩性氧化物，二氧化鋯能強(qiáng)烈吸附含羧基、巰基的脂肪和蛋白質(zhì)，將其制備成新型吸附劑用于魚(yú)肉[11]、植物油[12]、玉米和毛豆[13]樣品的前處理凈化，效果比較理想。本研究采用改進(jìn)的QuEChERS方法對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用高靈敏度和高分離能力的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS/MS)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)動(dòng)物性食品中10種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的簡(jiǎn)單、快速測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UItiMate3000 超高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司)；Milli-Q 去離子超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；3-30K 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；XW-80A 渦旋混合器(Kylin-Bell Lab Instruments)；OA-Sys 氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

氟氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氯菊酯、聯(lián)苯菊酯和醚菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>95.9%，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；冰乙酸(優(yōu)級(jí)純，上海安譜科技公司)；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；無(wú)水硫酸鎂(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；PSA、C18吸附劑(博納艾杰爾科技有限公司)；Z-Sep+吸附劑(美國(guó)Supelco公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1擬除蟲(chóng)菊酯單標(biāo)儲(chǔ)備液的配制將10種標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)用甲醇配成10 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于棕色小瓶中，于-18 ℃冰箱中保存，有效期為6個(gè)月。

1.2.2擬除蟲(chóng)菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制分別移取上述10種擬除蟲(chóng)菊酯單標(biāo)儲(chǔ)備液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容后制得100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于棕色小瓶中，于-18 ℃冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。臨用時(shí)，配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，70% B；2.0～6.3 min，70%～95% B；6.3～6.5 min，95%～70% B；6.5～10.0 min，70% B。

1.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓：3.8 kV；霧化溫度：210 ℃；離子傳輸溫度：250 ℃；鞘氣壓力：7.0×103Pa；輔助氣壓力：1.75×103Pa；碰撞氣壓力：0.2 Pa；10種擬除蟲(chóng)菊酯的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量及錐孔電壓等參數(shù)見(jiàn)表1。

1.4 樣品前處理

1.4.1樣品制備參照GB/T5009.162-2008[14]和文獻(xiàn)[15]的方法，對(duì)采集的樣品用粉碎裝置進(jìn)行處理，將處理好的樣品置于密閉干凈容器內(nèi)并做好標(biāo)記。試樣于-18 ℃以下冷凍保存，備用。

1.4.2樣品提取將所制得的樣品解凍后，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，加入1.0 g無(wú)水硫酸鎂、0.3 g無(wú)水乙酸鈉和0.6 g氯化鈉，再加入5.0 mL冰乙酸-乙腈(1∶ 99，體積比)提取液，渦旋均勻后，超聲提取10 min，8 800 r/min下離心3.5 min。將上清液全部移至另一15 mL具塞離心管中，重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。

1.4.3樣品凈化將待凈化液置于-18 ℃下冷凍1 h。取3.0 mL冷凍后的上清液于含有500 mg無(wú)水硫酸鎂、150 mg Z-Sep+和150 mg C18的15 mL離心管中，渦旋，8 800 r/min下離心3.5 min，取2.0 mL上清液于另一15 mL離心管中，40 ℃下氮吹至近干，用甲醇-水(3∶ 1，體積比)定容至1.0 mL，渦旋溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm有機(jī)相尼龍濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣的方式，將1 mg/L各擬除蟲(chóng)菊酯單標(biāo)溶液以20 μL/min的流速連續(xù)注入ESI源中，根據(jù)目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)特征，在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描(Full scan)，得到待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰[M+NH4]+。優(yōu)化離子源氣流、電壓、溫度等參數(shù)使離子峰的響應(yīng)強(qiáng)度最優(yōu)且響應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定子離子和優(yōu)化的碰撞能量。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 10種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的UPLC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 Optimal parameters of ten pyrethroids analyzed by UPLC-MS/MS

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇根據(jù)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的物理化學(xué)性質(zhì)，本研究選用農(nóng)殘分析常用的超高壓反相色譜柱ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)[16]和Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)[17]。通過(guò)比較兩種色譜柱對(duì)10種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的分離效果、峰形和保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在相同的程序洗脫條件下，前者的分離效果好，保留效果佳。因此最終選用ACQUITY HSS T3色譜柱。

圖1 10種擬除蟲(chóng)菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 10 pyrethroids mixed standard solution(100 μg/L)1.flucythrinate；2.λ-cyhalothrin；3.fenpropathrin；4.β-cypermethrin；5.deltamethrin；6.fenvalerate；7.fluvalinate；8.permethrinⅠ；9.permethrinⅡ；10.bifenthrin；11.etofenprox

2.2.2流動(dòng)相的選擇比較了甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同的調(diào)節(jié)劑甲酸(0.05%、0.1%和0.2%)、乙酸銨(2、5、10 mmol/L)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水相中加入甲酸時(shí)甲氰菊酯和醚菊酯的峰形較好，這是由于流動(dòng)相中加入甲酸后有利于形成[M+H]+，從而提高其離子化效率。但大部分目標(biāo)物的色譜峰仍拖尾嚴(yán)重；而向甲酸水流動(dòng)相中加入乙酸銨后，10種擬除蟲(chóng)菊酯均產(chǎn)生了[M+NH4]+母離子，且響應(yīng)強(qiáng)度增大。將有機(jī)相甲醇換成乙腈，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰的分離程度較差且出峰時(shí)間較晚。因此，本研究采用0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)-甲醇作為流動(dòng)相。

2.2.3洗脫程序的選擇由于10種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，采用等度洗脫目標(biāo)化合物會(huì)在色譜柱中共流出。本實(shí)驗(yàn)選取梯度洗脫程序，在參考文獻(xiàn)[18-20]的基礎(chǔ)上設(shè)置了5種梯度洗脫程序，綜合對(duì)比，最終選擇“1.3.1”的梯度洗脫程序。在優(yōu)化色譜條件下，10 min內(nèi)可完成對(duì)10種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的分析。其總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.3 提取溶劑的選擇

由于動(dòng)物組織的基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，極性較弱的目標(biāo)化合物一般較難從含油脂樣品中提取出來(lái)，所以本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、乙酸乙酯、丙酮及丙酮-正己烷(1∶ 1，體積比)作為提取溶劑時(shí)，對(duì)動(dòng)物性食品中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果表明，乙腈對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的回收率明顯高于其他3種溶劑。原因是乙腈對(duì)樣品中油脂和色素的提取量最小，在一定程度上降低了基質(zhì)干擾，有利于凈化，同時(shí)其對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的溶解度較高；乙酸乙酯的極性很弱，只提取了樣品中部分目標(biāo)化合物，回收率較低；而用丙酮和正己烷提取時(shí)，提取液中干擾物質(zhì)會(huì)增加，回收率較低。由于擬除蟲(chóng)菊酯在堿性條件下不穩(wěn)定，所以進(jìn)一步研究了乙腈與冰乙酸-乙腈(體積比1∶ 999、1∶ 99、2∶ 98)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示，加入少量的冰乙酸時(shí)回收率增加，而冰乙酸-乙腈(2∶ 98)的回收率低于冰乙酸-乙腈(1∶ 99)，可能是由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥在含1%冰乙酸的乙腈溶液中比較穩(wěn)定，而酸度過(guò)大時(shí)會(huì)抑制離子的傳輸效率。因此，選擇冰乙酸-乙腈(1∶ 99)作為提取溶劑。

2.4 吸附劑的選擇

提取液經(jīng)低溫冷凍凈化后，仍有部分雜質(zhì)，采用分散固相萃取方法對(duì)提取液再次凈化。而吸附劑種類(lèi)的選取是分散固相萃取的關(guān)鍵，其中PSA材料的硅膠表面鍵合有極性官能團(tuán)，具有極性吸附作用和弱陰離子交換功能，主要用于去除樣品中的有機(jī)酸、色素和金屬離子[21]；石墨化碳黑(GCB)具有片層結(jié)構(gòu)，是一種非極性吸附劑，主要用于去除樣品中的色素、甾醇和維生素，但因其吸附性較強(qiáng)易導(dǎo)致部分農(nóng)藥的回收率偏低[22]；C18的有效成分是硅膠鍵合的十八烷基，具有疏水性，主要用以去除脂肪和非極性物質(zhì)[23]；Z-Sep+是二氧化硅顆粒上同時(shí)以單鍵結(jié)合二氧化鋯和C18的新型吸附劑，能有效吸附脂肪和色素等，被用于高含油植物中農(nóng)藥的凈化處理[24]。

動(dòng)物性食品含有較多的脂肪、蛋白質(zhì)等干擾基質(zhì)，在樣品凈化的過(guò)程中既需除去油脂等干擾物質(zhì)，又需保留擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥，因此設(shè)計(jì)了4種凈化方式：① 150 mg PSA和150 mg C18；② 150 mg GCB和150 mg C18；③ 150 mg Z-Sep+和150 mg C18；④ 300 mg Z-Sep+，并在每組中均加入500 mg無(wú)水硫酸鎂。在25 μg/kg加標(biāo)水平下，按照“1.4”方法對(duì)長(zhǎng)毛明對(duì)蝦空白樣品進(jìn)行前處理，以回收率為指標(biāo)考察上述4種方式的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用PSA和C18凈化時(shí)，氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的回收率低于50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大；采用GCB和C18凈化時(shí)，回收率均較低，可能是GCB的吸附性過(guò)強(qiáng)所致；采用Z-Sep+凈化時(shí)，回收率低于60%，可能是Z-Sep+對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生了吸附；而采用Z-Sep+和C18凈化時(shí)，10種擬除蟲(chóng)菊酯的回收率為70%～120%，符合檢測(cè)方法的要求。對(duì)Z-Sep+和C18吸附劑的用量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用150 mg Z-Sep+和150 mg C18吸附劑能夠較好地凈化樣品。綜上所述，最終采用方法③對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1基質(zhì)效應(yīng)在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析的過(guò)程中，基質(zhì)效應(yīng)被認(rèn)為是誤差的重要來(lái)源，常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高或偏低[25]。基質(zhì)效應(yīng)(ME)可通過(guò)比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率進(jìn)行評(píng)估： 通常情況下，當(dāng)|ME|<20%時(shí)，為弱基質(zhì)效應(yīng)，可以忽略；當(dāng)20%≤|ME|≤50%時(shí)，為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)|ME|>50%時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，須采取方法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[26]。

按照“1.4”方法對(duì)空白樣品(長(zhǎng)毛明對(duì)蝦、鋸緣青蟹、豬肉、鴨肉)進(jìn)行前處理，然后配制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，氰戊菊酯在鋸緣青蟹中表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，氯菊酯在長(zhǎng)毛明對(duì)蝦和鋸緣青蟹中表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，聯(lián)苯菊酯在鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉中表現(xiàn)為弱的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，而其他擬除蟲(chóng)菊酯則表現(xiàn)為弱到中等的基質(zhì)抑制效應(yīng)。所以本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5.2線(xiàn)性范圍、檢出限與定量下限在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用長(zhǎng)毛明對(duì)蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉4種空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋?zhuān)渲瞥?.5～100 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計(jì)算目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以長(zhǎng)毛明對(duì)蝦空白基質(zhì)為例，結(jié)果見(jiàn)表2。4種空白樣品中各目標(biāo)物在線(xiàn)性范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997，LOD為0.9～2.4 μg/kg，LOQ為3.0～8.0 μg/kg，低于最大殘留限量(MRLs)[28]。

表2 長(zhǎng)毛明對(duì)蝦空白基質(zhì)中擬除蟲(chóng)菊酯的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限及定量下限 Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，linear ranges，LODs and LOQs of pyrethroids in blank Penaeus penicillatus

2.5.3回收率與精密度在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，選用長(zhǎng)毛明對(duì)蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉4種空白樣品，對(duì)10種擬除蟲(chóng)菊酯進(jìn)行10、50、100 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)3次，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表3。3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為70.3%～120%，RSD為1.2%～11.2%。結(jié)果滿(mǎn)足歐盟SANTE/11813/2017對(duì)食品中農(nóng)藥殘留分析的規(guī)定[27]。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到分析要求。

表3 10種擬除蟲(chóng)菊酯在樣品中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD)of ten pyrethroids in samples(n=6)

(續(xù)表3)

PesticideSpiked(μg/kg)Penaeus penicillatusScylla serrataPorkDuckRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)5098.5 2.7 86.0 5.2 106 2.7 1064.6 10088.9 6.5 96.8 3.9 89.8 4.5 99.2 7.2 Bifenthrin1073.8 9.3 96.1 7.5 113 1.9 81.3 4.3 501058.6 1123.0 103 3.5 106 5.9 10082.9 11.2 108 5.6 92.6 5.3 111 9.4 Etofenprox1089.59.397.48.11098.097.96.5501008.61015.71037.388.74.710099.26.199.05.099.73.899.78.3

2.5.4實(shí)際樣品的檢測(cè)為驗(yàn)證本方法在動(dòng)物性食品中的有效性，從廈門(mén)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)40份樣品，包括長(zhǎng)毛明對(duì)蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉，采用本方法對(duì)10種擬除蟲(chóng)菊酯進(jìn)行分析測(cè)定。其中2份長(zhǎng)毛明對(duì)蝦檢出高效氯氰菊酯，含量分別為3.7、5.2 μg/kg；1份鋸緣青蟹檢出高效氯氰菊酯，含量為6.1 μg/kg；1份鋸緣青蟹中檢出溴氰菊酯，含量為7.3 μg/kg；1份長(zhǎng)毛明對(duì)蝦檢出氟胺氰菊酯，含量為8.6 μg/kg；2份豬肉檢出高效氯氟氰菊酯，含量分別為6.7、8.0 μg/kg；1份鴨肉檢出溴氰菊酯，含量為5.5 μg/kg；1份鴨肉檢出氟胺氰菊酯，含量為5.8 μg/kg。結(jié)果均未超出最大殘留限量10 μg/kg的要求[28]。結(jié)果表明，該方法可用于動(dòng)物性食品中10種擬除蟲(chóng)菊酯的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)優(yōu)化提取溶劑和吸附劑，以及色譜和質(zhì)譜條件，建立了動(dòng)物性食品中10種擬除蟲(chóng)菊酯的改進(jìn)QuEChERS/UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明，本方法的前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可滿(mǎn)足動(dòng)物性食品中10種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的快速分析要求。