黃曉姍，關銘鑫，杭義萍

(華南理工大學 化學與化工學院，廣東 廣州 510640)

偶氮甲酰胺(ADA)作為一種食品添加劑，因具有增白及提高面制品性能等優(yōu)勢而被廣泛應用[1]。據(jù)報道，在面制品的加工過程中，偶氮甲酰胺會降解產(chǎn)生氨基脲(SEM)[2-4]，而SEM對動物均具有較強的致癌、致畸性等[5-7]。目前，我國規(guī)定ADA的最高添加量為45 mg/kg[8]，而歐盟一些國家禁止使用ADA作為添加劑[6]?！百惏傥丁笔录俅我鹆斯妼DA及其降解產(chǎn)物SEM的關注。目前，檢測SEM的方法主要有高效液相色譜法[9-10]、毛細管電泳法[11]、表面增強拉曼光譜法[12]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]等。其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)因靈敏度高、選擇性強等特點，成為檢測SEM的首選方法。Stadler等[4]采用HPLC-MS/MS對SEM進行檢測，比較了直接檢測SEM與經(jīng)衍生處理后再檢測兩種方法，并考察了ADA在160～240 ℃下的降解情況，但未研究不同烘烤時間對ADA降解的影響。日常生活中，人們常采用蒸煮的方式加工面制品，該工藝的溫度在100 ℃左右，目前尚無報道對該情況進行討論。本研究通過模擬蒸煮與烘烤工藝的溫度條件，采用HPLC-MS/MS法檢測SEM，考察了ADA在熱處理下的降解規(guī)律，為面制品中添加劑的安全使用提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20 AD XR高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；API-4000三重四極桿電噴霧質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，15 μm，澳大利亞SGE Analytical Science公司)；VERTEX70型傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；烘箱(上海申賢恒溫設備廠)；渦旋混勻儀(德國IKA公司)；PHB-3型筆式pH計(上海三信儀表廠)；Milli-Q純水機(Millipore公司,電阻率≥18 MΩ·cm)。

偶氮甲酰胺(AOA≥99.9%，美國AccuAtandard公司)；氨基脲鹽酸鹽(SEM·HCl,≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；15N213C-氨基脲鹽酸鹽(15N213C-SEM,≥99.0%，美國Sigma-Aldrich公司)；2-硝基苯甲醛(2-NBA,≥99.0%，美國Sigma公司)；乙酸乙酯(色譜純，天津福晨化學試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，江蘇永華化學試劑有限公司)；甲酸(色譜純，北京Dikma公司)；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1儀器條件液相色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，15 μm)；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.8 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，20% B；1～3 min，20%～90%B；3～6 min，90%B；6～6.5 min，90%～10%B；6.5～10 min，10%B。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(Electrospray，ESI)；電離模式：正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)；氣簾氣：25 psi；霧化氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；離子源電壓：5 500 V；衍生物2-硝基苯甲醛縮氨基脲(2-NPSEM)及其內(nèi)標15N213C-2-硝基苯甲醛縮氨基脲(15N213C-2-NPSEM)的監(jiān)測離子對(DP)、去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能(CE)、碰撞出口電壓(CXP)等參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of MS

*quantitative ion

1.2.2實驗設計稱取0.004 5 g ADA置于小坩堝中，選取烘烤時間為30 min，考察不同溫度(100、150、175、200、225、250 ℃)對ADA降解規(guī)律的影響；選取烘烤溫度為200、175、150 ℃，考察不同烘烤時間(10、20、30、40、50 min)對ADA降解規(guī)律的影響。

1.2.3樣品前處理將烘烤后的ADA溶于水中，定容至100 mL。取1 mL樣品溶液置于離心管中，加入50 μL15N213C-SEM溶液(1 mg·L-1)、100 μL 2-NBA溶液(0.1 mol/L)、2 mL 鹽酸溶液(0.2 mol/L)，渦旋混勻后置于37 ℃恒溫箱中反應16 h。取出冷卻至室溫，用鹽酸溶液(0.2 mol/L)、氫氧化鈉溶液(1 mol/L、0.1 mol/L)及磷酸二氫鉀溶液(0.3 mol/L)調(diào)至pH 7.0～7.5，加入3 mL乙酸乙酯進行萃取，渦旋振蕩后吸取上清液，再加入3 mL乙酸乙酯重復萃取1次，合并乙酸乙酯層，于40 ℃下氮氣吹干，再用1.00 mL乙腈和0.1%甲酸水溶液(體積比20∶ 80)復溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后裝入2 mL棕色小瓶，待測。

圖1 SEM衍生物的反應式Fig.1 Formation of SEM derivative

圖2 SEM衍生物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of SEM derivative

圖3 SEM衍生物的定量離子色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of SEM derivative

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

SEM的分子量為75 g·mol-1，分子量較小，若直接用質(zhì)譜檢測，會因轟擊能量過大而碎裂成無特征的碎片離子，導致檢測結果較差；且其極性較大，用色譜檢測時保留時間很短，不利于檢測，所以需將SEM進行衍生處理后再檢測。常用的衍生劑有2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl)[9]、芴甲氧乙酰氯(FMOC-Cl)[10]、2-硝基苯甲醛(2-NBA)[13-14]和4-硝基苯甲酰氯(4-NC)[16]，綜合考慮衍生劑穩(wěn)定性及檢出限等因素，最終選取2-NBA為SEM的衍生劑，衍生反應如圖1所示。該衍生步驟使得在碰撞誘導離解過程中能解離出具有特征性的碎片離子，提高了質(zhì)譜的靈敏度和選擇性。同時，在衍生前加入15N213C-SEM以減小樣品處理過程中的損失。

衍生后得到2-NPSEM的二級質(zhì)譜圖見圖2。由圖可知，子離子m/z192.1和m/z166.1的豐度較強、干擾較小，選其作為監(jiān)測離子。其中，以豐度最高的子離子m/z166.1作為定量離子，其提取色譜圖見圖3。

本研究還對衍生溫度及萃取pH值進行了討論，發(fā)現(xiàn)衍生溫度為37 ℃、萃取pH值為7.0時，方法的檢測效果最佳。

2.2 線性范圍、檢出限、回收率與精密度

配制系列濃度的SEM標準溶液，按“1.2.3”方法進行前處理，在選定的儀器參數(shù)下進行測定，以SEM與內(nèi)標物的峰面積比值與對應的SEM質(zhì)量濃度制作標準曲線。結果表明，SEM在0.5～100 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)(r)為0.999，按信噪比(S/N)為3計算得其檢出限為0.4 μg·L-1。在不同的樣品中分別添加10 、20、40 μg·L-1的SEM標準溶液，每個加標樣品平行測定6次，得到3個加標水平下SEM的回收率為99.6%～120%，相對標準偏差(RSD)均小于7.6%。

2.3 烘烤樣品的分析

同時本研究通過模擬蒸煮與烘烤的溫度模式，選取烘烤時間為30 min，采用HPLC-MS/MS檢測SEM，考察了ADA在各溫度下轉(zhuǎn)化為SEM的規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn)，當溫度為100 ℃時，SEM的生成量極少，幾乎為0。隨著烘烤溫度的增加，SEM的生成量明顯上升，烘烤溫度達到200 ℃時，SEM的生成率最高，為0.094%，隨著溫度的繼續(xù)升高，SEM的生成率急劇下降，這可能是因為過高的溫度，使得生成的SEM進一步分解。

圖4 樣品在蒸煮模式與烘烤模式下的定量離子色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of samples at cooking mode and baking mode

模擬對比了蒸煮模式與烘烤模式下SEM的生成量，100 ℃及200 ℃條件下的定量離子色譜圖見圖4。由圖4可知，在200 ℃下，SEM的生成量明顯高于100 ℃，因此，在日常生活中宜采取蒸煮方式加工面制品，從而減少SEM的攝入。

2.3.2烘烤時間對ADA降解的影響一般烘焙面包的溫度在200 ℃左右，本研究選擇200 ℃為烘烤溫度，考察不同烘烤時間對SEM生成率的影響。結果表明，隨著烘烤時間的增加，SEM的生成率逐漸上升，在30 min時達到最高，此后，SEM的生成率緩慢下降。同時考慮到煎炸等面制品的加工工藝，本研究也考察了175 ℃及150 ℃溫度下，不同烘烤時間對SEM生成率的影響，其變化趨勢與200 ℃時相似。

3 結 論

本研究采用HPLC-MS/MS對ADA的降解產(chǎn)物SEM進行檢測，同時還通過模擬蒸煮與烘烤工藝的溫度條件，采用HPLC-MS/MS檢測SEM，并考察了ADA在熱處理下的降解規(guī)律。研究表明，在熱處理條件下，ADA會降解生成SEM，高溫時，ADA基本轉(zhuǎn)化完全，同時過高的溫度會導致SEM分解，使得生成率下降；此外，過長的烘烤時間也會導致生成率下降。因此，健康生活應該采取溫度較低的蒸煮方式。