劉 薇，蔣舒凡，涂 雷，胡偉燚，王 濤，王 靜*

(1南京市職業(yè)病防治院藥劑科，南京 210042；2中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，南京 210009)

塵肺病是長期吸入粉塵并在肺內(nèi)潴留為病因，以肺組織彌漫性纖維化為最終結(jié)局的全身性疾病。塵肺是機(jī)體免疫功能紊亂和多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，其發(fā)生過程十分復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，探索塵肺病的早期發(fā)病機(jī)制和尋找安全有效的防治藥物依然任重而道遠(yuǎn)。

冬蟲夏草是傳統(tǒng)名貴中藥，現(xiàn)代藥理研究證明具有免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)劑和體液免疫抑制劑作用，能夠舒張血管，擴(kuò)張支氣管，在呼吸系統(tǒng)疾病和抗纖維化方面具有較好的應(yīng)用[1-3]。金水寶膠囊的主要成分為發(fā)酵蟲草菌粉，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗炎、止咳、祛痰、鎮(zhèn)靜、促性腺等作用，其主要藥理作用與青海天然蟲草相似。為了拓展塵肺病的治療方法，本研究在臨床療效觀察基礎(chǔ)上，建立大鼠塵肺模型，系統(tǒng)考察金水寶膠囊藥效作用，表明金水寶膠囊對(duì)于大鼠塵肺模型的呼吸功能和肺組織病變具有較好的改善作用，藥效作用具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。本研究從血液流變學(xué)、血管內(nèi)皮功能、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等幾個(gè)方面探討金水寶膠囊的作用機(jī)制，為本品臨床治療塵肺提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

金水寶膠囊(江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160609)；漢防己甲素片(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，批號(hào)：1602004)。石英粉(粒徑<5 μm，江蘇聯(lián)瑞新材料股份有限公司)，采用生理鹽水制備成50 mg/mL懸液供造模用。

水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、瑞氏染液(南京建成生物工程研究所)；轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、內(nèi)皮素(ET)及卵磷脂(PC)ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；CD4+、CD8+熒光抗體(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

KD-160型電子秤(東莞百利達(dá)健康器材有限公司)；BSA124S精密電子天平(德國賽多利斯公司)；LBY-N6A自清洗旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)(北京普利生公司)；Safire2多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；CELLtac α型血球分析儀(日本Nihon Kohden公司)。

1.3 動(dòng) 物

SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，雄性，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。大鼠均飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)使用性屏障系統(tǒng)內(nèi)，空氣潔凈度10 000級(jí)，實(shí)驗(yàn)室溫度(24±2) ℃；相對(duì)濕度60%～80%；每小時(shí)空氣交換次10～15次；光照周期：12 h(日)/12 h(夜)，每籠不超過5只。

2 方 法

2.1 劑量設(shè)置及依據(jù)

金水寶膠囊根據(jù)體表面積折算成大鼠為267.3 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)中大鼠受試劑量設(shè)為600、300 mg/kg，分別約相當(dāng)于臨床劑量的2倍和1倍。

漢防己甲素片根據(jù)體表面積折算成大鼠為27 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)中大鼠受試劑量設(shè)為30 mg/kg，約相當(dāng)于臨床劑量。

2.2 動(dòng)物模型的建立

雄性SD大鼠水合氯醛(10%，3 mL/kg)腹腔注射麻醉，臥位固定，于頸部切口，分離肌肉，暴露氣管，用1 mL注射器將預(yù)吸好的粉塵懸液1 mL經(jīng)氣管慢速注入(10 s)，注射完畢豎立大鼠，胸部按摩雙肺，使粉塵進(jìn)入肺內(nèi)。注射完畢，縫合頸部肌肉和皮膚，標(biāo)記并分籠飼養(yǎng)。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，采用本方法約在造模后3個(gè)月左右出現(xiàn)明顯的肺組織病變。本課題所用大鼠造模后3個(gè)月，進(jìn)行X射線胸片檢查，隨機(jī)取10只大鼠，取肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以出現(xiàn)輕-中度的肺泡炎(HE染色)和肺纖維化(MASSON染色)作為模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)，隨后按照以下方案開始分組給藥。

2.3 分組及給藥

取上述造模大鼠72只，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為以下4組：(1)模型組(生理鹽水)；(2)陽性藥漢防己甲素片30 mg/kg；(3)金水寶膠囊600 mg/kg；(4)金水寶膠囊300 mg/kg，每組18只；另取18只正常大鼠作為正常對(duì)照組。

各組大鼠灌胃給藥，每天1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥6個(gè)月，給藥體積均為1 mL/kg。

2.4 檢測指標(biāo)及時(shí)間點(diǎn)

分別于給藥后1、3、6個(gè)月，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組取6只大鼠，進(jìn)行以下指標(biāo)檢測：股動(dòng)脈采血，經(jīng)檸檬酸鈉抗凝，通過血液黏度計(jì)測定全血黏度、血漿黏度，考察受試藥物對(duì)血液流變學(xué)的影響。采用ELISA試劑盒測定血清TGF-β、TNF-α及IL-6水平。另取部分血液，肝素抗凝，流式細(xì)胞儀檢測血CD4+、CD8+等淋巴細(xì)胞數(shù)量。試劑盒測定血清MDA和SOD水平。

采血完畢處死大鼠，經(jīng)主氣管穿刺，分4次注入預(yù)冷PBS(共6 mL)，每次邊按摩肺部邊盡量完全回收液體。采用細(xì)胞分類計(jì)數(shù)儀測定支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)，余下灌洗液以2 000 r/min離心10 min，下層沉淀為細(xì)胞，制備涂片經(jīng)瑞氏染色，油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行白細(xì)胞分類。另取部分支氣管肺泡灌洗液，測定ET、NO和PC水平。

2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物在造模后1、3、6個(gè)月全血黏度和血漿黏度均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，金水寶膠囊高劑量對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)血漿黏度具有明顯的改善作用(P<0.05)，但對(duì)全血黏度僅有部分改善作用，未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。金水寶膠囊低劑量及漢防己片治療組對(duì)于模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)亦可見部分改善作用，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(表1)。

Groupt/monthWhole blood viscosity (m·Pas)5/s-130/s-1200/s-1Plasma viscosity/(mPa·s)Control11.95±0.311.00±0.220.69±0.190.43±0.1232.86±0.441.65±0.220.88±0.130.53±0.1162.78±0.421.67±0.320.86±0.110.74±0.13Model12.79±0.70*1.47±0.42*1.03±0.22*1.41±0.62**33.95±0.47**1.97±0.19*1.12±0.21*1.22±0.19**63.56±0.51*2.25±0.39*1.27±0.40*1.25±0.19**Tetrandrine(30 mg/kg)12.53±0.321.23±0.260.82±0.180.89±0.1533.32±0.531.83±0.141.02±0.201.01±0.1663.34±0.502.08±0.421.02±0.141.05±0.22JinShuiBao(600 mg/kg)12.24±0.311.11±0.360.90±0.120.77±0.27#33.39±0.521.70±0.231.02±0.190.85±0.12#63.16±0.141.94±0.221.00±0.220.95±0.18#JinShuiBao(300 mg/kg)12.40±0.611.22±0.321.00±0.141.26±0.3733.58±0.491.77±0.131.06±0.141.05±0.1863.26±0.242.04±0.241.01±0.191.07±0.12

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vsmodel group

3.2 對(duì)血中炎癥因子和免疫細(xì)胞的影響

在6個(gè)月試驗(yàn)期間，模型大鼠血清TGF-β、TNF-α和IL-6炎癥因子均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。金水寶膠囊高劑量可明顯降低血清TGF-β、TNF-α和IL-6水平，低劑量對(duì)血清炎癥因子也部分的改善作用。漢防己甲素對(duì)血清炎癥因子具有明顯的抑制作用(P<0.05，P<0.01)(表2)。

與正常動(dòng)物相比，模型大鼠CD4+和CD8+/CD8+水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，金水寶膠囊高劑量均能顯著降低CD4+/CD8+水平(P<0.05，P<0.01)，低劑量也有部分改善作用。漢防己甲素也可以明顯降低CD4+和CD4+/CD8+水平(P<0.05，P<0.01)(表3)。

Groupt/monthTGF-β/(pg/mL)TNF-α/(pg/mL)IL-6/(pg/mL) Control1347.9±67.033.9±8.191.8±7.33387.0±89.837.2±7.690.9±7.36372.4±86.036.8±5.994.1±8.5Model1542.0±73.3**51.7±6.4**114.0±12.3**3505.0±63.4*51.0±6.3**112.0±7.7**6492.3±55.5*51.9±9.5**119.8±13.3**Tetrandrine(30 mg/kg)1402.8±54.5##40.8±7.0#98.7±8.7#3402.2±49.4#41.3±6.1#101.3±4.4#6392.1±64.1#39.5±9.6#97.7±13.5#JinShuiBao(600 mg/kg)1421.2±85.3#39.4±6.6##94.4±11.5#3403.6±88.5#40.1±6.8#99.4±8.8#6380.4±73.6#38.7±9.4#104.3±10.3#JinShuiBao(300 mg/kg)1480.8±55.742.8±8.895.4±9.1#3415.4±60.2#41.8±8.0#100.9±9.96385.9±73.7#36.7±9.9#105.4±12.0

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Groupt/monthCD8+(%)CD4+(%)CD4+/CD8+Control115.6±1.721.8±5.31.40±0.26313.7±2.521.5±3.31.59±0.26613.1±2.220.9±2.51.61±0.23Model113.4±1.328.3±1.2*2.12±0.12**316.7±1.2*31.9±2.0**1.91±0.13*613.4±2.728.4±2.8**2.17±0.31*Tetrandrine(30 mg/kg)112.7±1.922.4±1.2##1.78±0.17##317.5±1.028.1±0.8##1.61±0.08##613.9±1.625.0±1.1#1.81±0.14#JinShuiBao(600 mg/kg)116.1±3.925.9±4.21.67±0.38#316.9±1.727.1±1.8##1.61±0.09##616.8±2.329.8±2.31.79±0.12#JinShuiBao(300 mg/kg)112.1±2.023.8±1.6#2.01±0.25316.0±3.729.9±3.71.90±0.19611.5±3.621.2±2.2##2.00±0.66

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

3.3 對(duì)血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示，6個(gè)月試驗(yàn)期間，塵肺模型大鼠血清MDA水平顯著升高，而SOD活力顯著下降(P<0.05，P<0.01)，金水寶膠囊高劑量可明顯降低模型大鼠血清MDA水平，并升高SOD活力(P<0.05)，低劑量也可見部分改善作用。漢防己片對(duì)模型大鼠血清MDA和SOD水平未見明顯影響(表4)。

3.4 對(duì)支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及成分的影響

與正常大鼠相比，塵肺模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)，白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)可見巨噬細(xì)胞比率明顯降低(P<0.01)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比率明顯增高(P<0.01)。與模型組相比，金水寶膠囊高劑量可明顯降低模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)對(duì)于白細(xì)胞分類也有明顯調(diào)節(jié)作用(P<0.05，P<0.01)，低劑量部分時(shí)間點(diǎn)也可見較明顯的改善作用。漢防己甲素也可顯著降低模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)對(duì)于白細(xì)胞分類也有明顯調(diào)節(jié)作用(P<0.05，P<0.01)(表5)。

Groupt/monthMDA/(nmol/mL)SOD/(U/mL)Control111.2±2.5132.9±9.1313.1±3.2117.7±8.9613.2±1.9114.8±8.9Model116.4±2.4**114.4±10.5**319.7±4.6*95.4±14.1**617.8±3.4*94.3±17.7*Tetrandrine(30 mg/kg)114.1±4.3123.9±14.5316.0±3.3107.4±7.6615.6±4.5102.1±11.1JinShuiBao(600 mg/kg)112.8±3.1#126.8±6.7#314.6±2.2#115.3±9.2#613.4±2.6#111.8±6.2#JinShuiBao(300 mg/kg)113.7±1.7117.0±15.3315.8±1.8113.4±5.9#614.8±4.4109.3±7.6

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

支氣管肺泡灌洗液生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示，自造模1個(gè)月開始，模型大鼠ET和NO水平即顯著升高(P<0.05，P<0.01)，而PC水平隨著模型的時(shí)間進(jìn)展逐漸升高，自造模第3月起達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.01)。與模型組相比，金水寶膠囊高劑量全部試驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)支氣管肺泡灌洗液ET、NO和PC水平均有明顯改善作用，而低劑量第1月具有部分改善作用，而3月后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的改善作用。漢防己甲素可明顯降低6個(gè)月內(nèi)支氣管肺泡灌洗液ET水平(P<0.05，P<0.01)，給藥6個(gè)月使得NO水平也有明顯降低(P<0.05)，同時(shí)給藥3和6個(gè)月PC水平有明顯升高(P<0.05，P<0.01)(表6)。

Groupt/monthWBC/(×108·L-1)Ratio/%MacrophagesNeutrophilsLymphocyteControl11.60±0.2387.85±7.432.05±0.583.93±1.0631.88±0.1579.77±4.782.23±0.303.87±0.6061.92±0.2778.62±5.162.57±0.313.43±0.60Model13.10±0.65**73.83±5.95**9.22±0.98**10.20±2.99**32.90±0.40**66.92±6.75**6.32±0.62**11.22±1.75**62.90±0.41**63.57±2.74**7.53±0.85**11.42±1.71**Tetrandrine(30 mg/kg)12.05±0.25##82.95±5.92#6.42±1.07##7.00±0.91#32.18±0.25##75.23±3.66#4.80±0.94##8.12±1.09##62.37±0.29#71.57±5.95#5.22±0.60##8.15±1.00##JinShuiBao(600 mg/kg)12.15±0.34#82.97±4.76#6.67±0.35##7.08±1.39#32.23±0.33#75.55±5.21#5.02±0.56##8.72±1.24#62.33±0.31#72.00±5.65##5.95±0.69##8.68±1.63#JinShuiBao(300 mg/kg)12.28±0.31#79.33±4.456.95±0.40##8.85±1.7632.38±0.33#73.07±6.385.43±0.44#9.65±1.6462.43±0.3669.05±8.306.00±0.58##9.85±1.08

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

Groupt/monthET/(pg/mL)NO/(μmol/L)PC/(mmol/L)Control111.4±2.839.5±5.30.75±0.18310.6±1.639.7±5.50.88±0.30610.6±3.940.1±4.60.79±0.26Model116.9±2.6**45.7±3.1*0.89±0.42321.5±2.0**46.7±5.2*2.04±0.57**623.5±5.2**50.6±5.2**2.75±0.36**Tetrandrine(30 mg/kg)113.7±1.3#41.2±4.20.68±0.17316.2±1.8##41.8±3.41.29±0.56#615.6±5.7#43.5±2.6#1.41±0.45##JinShuiBao(600 mg/kg)112.7±3.0#40.5±4.3#0.76±0.15314.2±4.0##39.7±5.2#1.11±0.14##614.0±4.8##42.1±3.4##1.34±0.34##JinShuiBao(300 mg/kg)114.3±5.941.1±4.40.78±0.16315.7±4.8#39.9±5.2#1.17±0.47#615.6±3.6#42.4±7.3#1.85±0.46##

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group

4 討 論

塵肺患者由于肺部組織改變、長期缺氧導(dǎo)致血管阻力增加、心肌重構(gòu)、心功能下降等眾多心血管系統(tǒng)改變，同時(shí)在炎癥因子刺激下，引起血流減緩、血栓形成、血液黏滯，削弱了血液輸氧功能，進(jìn)而加劇機(jī)體呼吸困難和機(jī)體缺氧[4]。金水寶膠囊高劑量對(duì)于塵肺大鼠模型各時(shí)間點(diǎn)血漿黏度具有明顯的改善作用，對(duì)全血黏度有部分改善作用，表明本品對(duì)于塵肺狀態(tài)下血液流變具有一定改善作用。

從塵肺的慢性期到纖維化階段，肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞釋放活性介質(zhì)及細(xì)胞因子，引起白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的聚集，加劇炎性因子的增多與釋放，造成肺損傷[5]。在塵肺致病中的作用，TNF-α通過與其受體結(jié)合發(fā)揮作用，激活中性粒細(xì)胞，改變血管內(nèi)皮通透性，活化T和B淋巴細(xì)胞，參與塵肺的免疫病理反應(yīng)[6]。有研究表明，IL-6也是介導(dǎo)塵肺炎細(xì)胞活化及膠原沉積的重要細(xì)胞因子[7]。作為TGF-β可通過上調(diào)膠原和纖維黏連蛋白基因的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的增多，從而參與塵肺的纖維化過程[8]。CD4+和CD8+T細(xì)胞是肺部炎癥反應(yīng)時(shí)炎性因子的主要來源，模型大鼠CD4+和CD4+/CD8+水平均明顯升高，變化趨勢與炎癥因子水平一致，提示T淋巴細(xì)胞的激活和參與。本實(shí)驗(yàn)中，金水寶膠囊可明顯降低血清TGF-β、TNF-α和IL-6水平，同時(shí)顯著降低CD4+/CD8+水平，具有一定的劑量相關(guān)性，表明本品對(duì)于塵肺狀態(tài)下的系統(tǒng)性免疫細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)具有較好的改善作用。

肺心病是塵肺的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，常反復(fù)急性加重，隨肺功能的損害病情逐漸加重，多數(shù)預(yù)后不良[9]。研究表明，肺動(dòng)脈高壓是導(dǎo)致肺心病的直接因素之一，而肺組織中ET、NO等血管活性物質(zhì)與內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)，對(duì)肺動(dòng)脈高壓具有關(guān)鍵性作用[10]。肺間質(zhì)纖維化時(shí)伴有Ⅱ型細(xì)胞增生，故此時(shí)肺泡組織中卵磷脂(PC)水平會(huì)明顯升高，因此測定支氣管肺泡灌洗液中PC水平，可間接反映肺組織纖維化進(jìn)展程度[11]。本實(shí)驗(yàn)中，金水寶膠囊高劑量可明顯降低模型大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量，對(duì)支氣管肺泡灌洗液ET、NO和PC水平均有明顯改善作用，提示本品對(duì)于塵肺模型的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能具有明顯的改善作用，同時(shí)緩解肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。

當(dāng)粉塵進(jìn)入肺內(nèi)后，主要由肺泡巨噬細(xì)胞吞噬清除，粉塵可激活自由基反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，SOD作為氧自由基的清除劑，可能出現(xiàn)消耗性減少；而MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物含量，可能會(huì)增多[12]。金水寶膠囊對(duì)于模型大鼠血清MDA和SOD水平具有劑量依賴性的改善作用，表明本品可以調(diào)節(jié)塵肺狀態(tài)下的機(jī)體氧化/抗氧化狀態(tài)失衡。

由此可見，金水寶膠囊對(duì)于塵肺模型大鼠的改善作用涉及血液黏度、全身及肺組織炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷、機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、肺組織纖維化等多方面的作用機(jī)制?；诮鹚畬毮z囊改善塵肺模型作用特點(diǎn)和機(jī)制的探討，本研究在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)踐中，會(huì)更加深入和細(xì)致地開展相關(guān)工作，不斷提升塵肺病的防治水平。