陳蘇婷，陳 松，高向東

(中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，南京 210009)

成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)是由FGF基因家族編碼的一種蛋白質(zhì)，主要在肝臟、胰腺及脂肪組織中表達[1]。一直以來，以FGF21為代表的FGF亞家族成員都是糖脂代謝研究的熱點[2]。近年來，F(xiàn)GF21在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的生物學作用逐漸受到人們的關(guān)注[3]。研究顯示，F(xiàn)GF21及其受體在腦內(nèi)廣泛表達，為FGF21在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用提供了可能[4]。

作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物，提高腦內(nèi)分布是發(fā)揮藥效的一個重要前提。雖然FGF21可以通過簡單擴散的方式進入血-腦脊液屏障，但速率較低，僅為白蛋白的4倍[5]。細胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)常常作為遞藥載體，將藥物輸送至細胞內(nèi)，甚至是血-腦脊液屏障內(nèi)[6]。對于那些本身能夠進入血-腦脊液屏障的分子(如胰島素、GLP-1、exendin-4等)，利用CPPs作為遞藥載體，除了能增加目的分子穿過血-腦脊液屏障的速率，還可以增加其進入細胞的能力及其在某些器官、組織中的吸收及分布[7]。目前已有文獻報道，CPPs可以引導蛋白質(zhì)藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。細胞穿透肽TAT是最常用的CPPs之一，富含堿性氨基酸，可以攜帶核酸、多肽、蛋白、脂質(zhì)體、納米顆粒等分子進入細胞，且具有較低的細胞毒性[9-10]。這種穿膜方式不依賴經(jīng)典的胞吞作用，不需要受體介導，不消耗能量，而是依賴于TAT所帶正電荷與細胞膜之間的靜電作用[11]。TAT與蛋白藥物連接后，可以介導大分子進入腦內(nèi)從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。例如，Yin等[12]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射TAT-Bcl-xL能明顯抑制由腦缺血引起的神經(jīng)細胞凋亡及壞死。作為一種有效的轉(zhuǎn)運工具，TAT在藥物轉(zhuǎn)運、基因轉(zhuǎn)染及細胞融合等方面具有廣闊的發(fā)展前景[13]。

本實驗通過構(gòu)建含pET28a-TAT-FGF21的工程菌，經(jīng)誘導表達和Ni-NTA親和色譜柱分離純化得到TAT-FGF21融合蛋白。隨后建立Aβ25-35致SH-SY5Y細胞損傷模型[14]，考察該模型下TAT-FGF21對細胞活性、ROS生成水平、線粒體膜電位的影響，從細胞水平上初步驗證TAT-FGF21的神經(jīng)保護活性。

1 材 料

1.1 試 劑

pET28a-TAT-FGF21質(zhì)粒(中國蘇州金唯智生物科技有限公司)；Ni-NTA純化介質(zhì)、質(zhì)粒測序(中國金斯瑞生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(中國碧云天生物技術(shù)研究所)；蛋白標準Marker(美國Thermo公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；卡那霉素、胰蛋白酶、MTT(中國Biosharp公司)；Aβ25-35[中國吉爾生化(上海)有限公司]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀 器

電泳儀(美國Bio-Rad公司)；電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；細胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、全波長酶標儀(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 菌株與細胞

E.coliBL-21(DE3)、神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株購自美國菌種保藏中心(ATCC)。

2 方 法

2.1 TAT-FGF21表達菌株的構(gòu)建

將His標簽(HHHHHH)與細胞穿透肽TAT(YGRKKRRQRRR)添加到FGF21的N端，構(gòu)建pET28a-TAT-FGF21重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL-21(DE3)感受態(tài)細菌，接種于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)14 h，挑取陽性單克隆，于LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，制成甘油菌保存并測序。

2.2 TAT-FGF21融合蛋白的表達

TAT-FGF21的重組菌經(jīng)測序鑒定正確后，取甘油菌200 μL接種于含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基20 mL中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)物2 mL接種于含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基200 mL中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)。待A600達0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L 誘導蛋白表達，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體。以洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗滌菌體1次，稱量濕菌重。

2.3 TAT-FGF21融合蛋白的純化

TAT-FGF21融合蛋白在37 ℃下以包涵體形式表達。按10 mL/g濕菌加入破菌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)重懸菌體。功率50%，超聲3 s，間隔5 s，冰浴超聲30 min。超聲破碎后4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集沉淀。沉淀(含包涵體)用洗滌緩沖液洗滌1次，之后用梯度緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 8.0)洗滌2次。沉淀稱重，按10 mL/g加入變性液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，10 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 8.0)，4 ℃攪拌過夜。將變性液4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清液，并量取體積，使用Ni-NTA親和色譜柱進行純化。過柱時預先用平衡液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，pH 8.0)平衡，隨后上樣，上樣結(jié)束后以平衡液充分平衡色譜柱，以洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)去除雜蛋白，以洗脫液(20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白，收集洗脫組分。SDS-PAGE電泳檢測洗脫組分，將目的蛋白含量高的組分在4 ℃攪拌下緩慢滴加至10倍體積的復性緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，1 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0)中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌2 h。復性完成后，將復性的蛋白溶液4 ℃、12 000 r/min離心20 min除去不溶物，上清液透析至PBS中。經(jīng)超濾濃縮后，SDS-PAGE電泳檢測純化的目的蛋白，并利用BCA法測定蛋白濃度。

2.4 Aβ25-35寡聚體的制備

準確稱取Aβ25-3510 mg，加入雙蒸水10 mL，充分溶解；在超凈臺中使用孔徑為0.22 μm的微孔濾器過濾除菌，置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行寡聚化。4 d后從培養(yǎng)箱中取出，取少量用于BCA法測定蛋白濃度，其余-20 ℃保存待用。

2.5 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，根據(jù)生長情況，2～3 d傳代1次。

2.6 MTT法檢測TAT-FGF21對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞損傷的干預作用

收集生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞，以每毫升5×104個細胞的密度接種于96孔板，每孔100 μL，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。選擇0.125 μmol/L Aβ25-35作為造模使用濃度，損傷SH-SY5Y細胞8 h后，給藥組加入濃度為1 μmol/L的TAT-FGF21進行干預，共孵育48 h后MTT法檢測各實驗組細胞活性。同時設置空白組，每組設置6個復孔。具體步驟為：每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸去各孔中的培養(yǎng)基，分別加入DMSO 150 μL，置于搖床上振蕩10 min使結(jié)晶物溶解完全，使用酶標儀測定各孔的吸收度(以570 nm為檢測波長，630 nm為參比波長)。

2.7 DCFH-DA探針法檢測Aβ25-35及TAT-FGF21對SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS生成水平的影響

收集生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞，以每毫升5×104個細胞的密度接種于6孔板，每孔1 mL，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。選擇0.125 μmol/L Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞8 h后，給藥組加入濃度為1 μmol/L 的TAT-FGF21進行干預。共孵育48 h后，DCFH-DA探針法檢測各實驗組SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平。具體步驟為：用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將DCFH-DA(10 mmol/L)探針按1∶1 000比例稀釋，使終濃度為10 μmol/L；吸棄6孔板中舊培養(yǎng)基，每孔加入無血清培養(yǎng)基1 mL，潤洗1次；吸棄培養(yǎng)基，每孔加入稀釋好的DCFH-DA溶液1 mL，37 ℃孵育20 min；吸棄DCFH-DA溶液，每孔加入無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1 mL，重復3次，以充分去除游離的DCFH-DA；熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.8 JC-1探針法檢測Aβ25-35及FGF21對SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響

細胞鋪板及干預具體實驗方法同“2.7”項。共孵育48 h后，JC-1熒光探針法檢測各實驗組SH-SY5Y細胞的線粒體膜電位。具體步驟為：取JC-1(200×)探針50 μL，加入超純水8 mL，充分溶解后再加入JC-1染色緩沖液(5×)2 mL，混合均勻，配制成JC-1染色工作液；吸棄6孔板中舊培養(yǎng)基，每孔加入PBS 1 mL，潤洗1次，每孔再加入無血清培養(yǎng)基1 mL；每孔加入JC-1染色工作液1 mL，37 ℃孵育20 min；吸棄JC-1染色工作液，每孔加入1×JC-1染色緩沖液洗滌細胞，重復2次，以充分去除游離的JC-1；每孔加入無血清培養(yǎng)基2 mL，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結(jié) 果

3.1 TAT-FGF21融合蛋白的構(gòu)建

將構(gòu)建的pET28a-TAT-FGF21重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL-21(DE3)，通過抗生素篩選獲得陽性菌落，經(jīng)EcoRV、NdeI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)大小約為4 600及1 400 bp的兩條條帶(圖1)，表明質(zhì)粒大小基本正確。經(jīng)測序，結(jié)果與預期設計的序列完全一致，表明成功構(gòu)建了含pET28a-TAT-FGF21的E.coliBL-21(DE3)工程菌。

Figure1 Identification of pET28a-TAT-FGF21 construction

Lane M:Nucleic acid marker；Lane 1:Undigested pET28a-TAT-FGF21；Lane 2:pET28a-TAT-FGF21 digested withEcoRV andNdeI

3.2 TAT-FGF21融合蛋白的表達

利用IPTG誘導TAT-FGF21融合蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果(圖2)顯示，隨著誘導時間的增加，目的蛋白逐漸表達，在誘導5 h后表達量達到最大值，約為總蛋白的30%，主要以包涵體形式表達。TAT-FGF21蛋白在SDS-PAGE電泳圖中表現(xiàn)出高于其理論相對分子質(zhì)量的性質(zhì)，約為28 kD(理論相對分子質(zhì)量為22.4 kD)。

3.3 TAT-FGF21融合蛋白的純化

蛋白經(jīng)Ni-NTA親和色譜柱純化后，采用SDS-PAGE進行鑒定，結(jié)果(圖3)顯示，純化后的蛋白相對分子質(zhì)量約28 kD，呈單一條帶，純度約為92%。

Figure2 SDS-PAGE analysis of TAT-FGF21 expression

Lane M:Protein marker；Lane 1:Pro-induced；Lane 2-6:after-induced for 1,3,5,7,9 h；Lane 7:Supernatant after ultrasonic breakage；Lane 8:Precipitation after ultrasonic breakage

Figure3 SDS-PAGE analysis of TAT-FGF21 purification

Lane M:Protein marker；Lane 1:TAT-FGF21

3.4 TAT-FGF21對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞損傷的干預作用

選擇0.125 μmol/L Aβ25-35作為損傷濃度，損傷8 h后，加入1 μmol/L TAT-FGF21共孵育48 h，MTT法檢測細胞活性。結(jié)果(圖4)顯示，Aβ25-35組SH-SY5Y細胞活性顯著下降，約為空白組的40%，以1 μmol/L TAT-FGF21進行干預后SH-SY5Y細胞活力約提高10%，說明TAT-FGF21對Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞損傷有一定程度的改善作用。

###P<0.001vscontrol group;***P<0.001vsAβ25-35group

3.5 TAT-FGF21對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS生成增加的干預作用

采用DCFH-DA熒光探針法檢測不同干預條件下SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果(圖5)顯示，與空白組相比，模型組出現(xiàn)較強的綠色熒光，說明Aβ25-35能夠引起SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS顯著升高；而給藥組與模型組相比，熒光強度明顯減弱，表明TAT-FGF21能夠降低Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞內(nèi)升高的ROS水平。

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsAβ25-35group

3.6 TAT-FGF21對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞內(nèi)線粒體膜電位下降的干預作用

JC-1熒光探針法檢測不同干預條件下SH-SY5Y細胞線粒體膜電位水平。結(jié)果(圖6)顯示，與空白組相比，模型組JC-1探針單體較多，出現(xiàn)較強的綠色熒光，說明Aβ25-35引起SH-SY5Y細胞線粒體膜電位降低，細胞出現(xiàn)早期凋亡；給藥組JC-1探針多形成聚合物，存在于線粒體基質(zhì)中，出現(xiàn)較強的紅色熒光，說明給藥組線粒體膜電位趨于正常。結(jié)果表明，TAT-FGF21能夠調(diào)節(jié)Aβ25-35引起的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位降低水平。

4 討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer disease′s，AD)是神經(jīng)退行性疾病中的一種常見類型，以認知障礙為主要臨床表現(xiàn)[15]。AD在成人死亡原因之中排第6位[16]，給患者、患者家屬以及整個社會帶來了巨大的經(jīng)濟壓力與精神負擔。然而，AD的預防手段和治療藥物十分有限。迄今為止，F(xiàn)DA與SFDA僅批準了6種AD治療藥物，即他克林、多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏、美金剛和石杉堿甲[17]。然而，這些藥物也只能通過干預治療在一定程度上緩解AD的相關(guān)癥狀，在臨床應用中也常常呈現(xiàn)出不同程度的不良反應[18]。近期研究顯示，F(xiàn)GF21可以改善肥胖胰島素抵抗雄性大鼠的突觸可塑性、樹突狀棘密度、腦線粒體功能和細胞凋亡，從而提高肥胖大鼠的認知功能[19]，提示FGF21可能具有防治AD等神經(jīng)退行性疾病的潛力。為了增加FGF21穿過血-腦脊液屏障的速率、提高FGF21的腦內(nèi)分布、增加FGF21防治AD等神經(jīng)退行性疾病藥物的可行性，本研究構(gòu)建了TAT-FGF21原核表達菌株，經(jīng)誘導表達、分離純化獲得了TAT-FGF21融合蛋白。

Figure6 Effects of TAT-FGF21 on Aβ25-35-induced mitochondrial damage in SH-SY5Y cells.Mitochondrial membrane potential of different cell groups was viewed by JC-1 staining and confocal laser scanning microscope.The healthy mitochondria exhibited the red fluorescence staining characteristic of JC-1 aggregation while abnormal mitochondria exhibited the green fluorescence staining characteristic of JC-1 monomer (n=3)

目前，AD的發(fā)病機制尚無定論?！唉?淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)級聯(lián)假說”認為Aβ聚集是AD發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，Aβ的寡聚化與沉積對神經(jīng)細胞具有異常毒性，可造成突觸損傷、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元死亡，從而引起AD的發(fā)生[20]。Aβ是目前最常用于建立AD模型的物質(zhì)之一。研究表明，Aβ對神經(jīng)的損傷作用與氧化應激密切相關(guān)，Aβ可以進入線粒體，阻礙能量代謝過程，誘導大量ROS的生成，損傷線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，引起線粒體膜電位下降，最終導致神經(jīng)細胞凋亡[21]。因此，為了進一步探討TAT-FGF21的神經(jīng)保護作用，本研究利用寡聚化的Aβ25-35與SH-SY5Y細胞共孵育建立神經(jīng)細胞損傷模型，并以TAT-FGF21進行干預，考察了TAT-FGF21對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞活性下降、ROS生成增加、線粒體膜電位異常下降的干預作用。實驗結(jié)果表明，TAT-FGF21融合蛋白可以通過緩解氧化損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為AD等神經(jīng)退行性疾病藥物的開發(fā)提供了新的思路。