王 紅， 毋若楠， 王爭(zhēng)艷， 楊成成， 武永軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

土壤鹽漬化導(dǎo)致環(huán)境退化，嚴(yán)重影響著作物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。土壤中鹽離子濃度過(guò)高會(huì)造成植物根系吸水困難，使植物體內(nèi)含水量下降，膨壓降低，引起植物細(xì)胞脫水死亡，甚至影響植物自身的生存[1]。目前，我國(guó)大約有0.33億hm2鹽堿地，而大量農(nóng)作物耐鹽性差，在鹽堿地中無(wú)法種植，因此，如何提高農(nóng)作物的耐鹽性，對(duì)擴(kuò)大我國(guó)耕地面積具有現(xiàn)實(shí)意義。

miRNAs是植物體內(nèi)普遍存在的一類小分子非編碼RNA，其長(zhǎng)度在24 nt左右[2]。miRNAs廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、果實(shí)發(fā)育、對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)等過(guò)程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥[4]、玉米[5]中都存在響應(yīng)鹽脅迫的miRNAs。目前研究miRNAs功能的方法有過(guò)表達(dá)和基因沉默等。向娟等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)番茄的miR397能夠增強(qiáng)擬南芥的抗旱性[6]。2014年Gu等構(gòu)建了沉默miR165/166的STTM(short tandem target mimic，即短串聯(lián)靶標(biāo)模擬)載體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花中靶標(biāo)基因的表達(dá)量明顯上升[7]。

當(dāng)土壤環(huán)境中鹽離子濃度較高時(shí)，會(huì)破壞植物細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，引起膜功能異常，代謝活動(dòng)減弱，從而影響生長(zhǎng)[8]。當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，活性氧積累且高度活躍，刺激植物通過(guò)抗氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)清除活性氧[9]，使植物體內(nèi)清除活性氧相關(guān)酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，簡(jiǎn)稱POD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，簡(jiǎn)稱CAT)等活性升高[10-11]。此外，在脅迫下，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生丙二醛(malonaldehyde，簡(jiǎn)稱MDA)，因此，可以通過(guò)丙二醛了解膜系統(tǒng)受傷害的程度[12]。保護(hù)酶活性及MDA含量已被廣泛用來(lái)衡量植物受脅迫的程度。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在之前利用高通量測(cè)序研究了NaCl處理下玉米miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)zma-miR059的表達(dá)量在NaCl脅迫下顯著上升。因此本研究以先玉335為試驗(yàn)材料，試圖明確zma-miR059與鹽脅迫的關(guān)系，以期為從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控角度改進(jìn)植物的耐鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米品種和接種的菌株 玉米品種為先玉335，載體pOT2-Poly-cis、pFGC5941-PacI和農(nóng)桿菌GV3101為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理和樣品采集 將玉米種子進(jìn)行消毒、萌發(fā)處理，當(dāng)玉米芽長(zhǎng)到2 cm時(shí)，用棉花包裹種子，留出根部，插入自制的玉米水培盆小孔中，每天用通氣泵通氣3次。用蒸餾水培養(yǎng)3 d后換Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉期，挑出長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗進(jìn)行處理。分根處理(將玉米根系分為大致相等的2個(gè)部分)：將2個(gè)部分的根分別放入正常的Hoagland培養(yǎng)液和含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培養(yǎng)液中。全部根系NaCl處理：將玉米根系全部放入含有200 mmol/L NaCl的Hoagland培養(yǎng)液中。對(duì)照：將全部根系放入不含NaCl的Hoagland培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2 d后，取樣進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)條件：光—暗周期為15 h—9 h，晝—夜溫度周期為28 ℃—20 ℃。

1.2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取葉片和根系總RNA。提取RNA后用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，上海)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄參照Chen等發(fā)明的stem-loop RT-PCR，設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAC GATC-3′(5′末端是44個(gè)固定堿基，3′末端的8個(gè)堿基與miRNA成熟體的3′端互補(bǔ)配對(duì))[13]。反應(yīng)體系為20 μL：2.5 μL 總RNA、4 μL反應(yīng)緩沖液、1 μL反轉(zhuǎn)錄引物、2 μL MgCl2、1 μL dNTPs、1 μL RNA酶抑制劑、1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，7.5 μL 水。反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用Promega公司的GoTaq?qPCR Master Mix，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。選擇18S rRNA為內(nèi)參，zma-miR059和內(nèi)參的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。反應(yīng)體系為 20 μL：10 μL 2×GoTaq?qPCR Master Mix，7.4 μL水，各 0.3 μL 上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。在65～95 ℃，每升高0.5 ℃采集1次熒光，生成溶解曲線。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，陰性對(duì)照以ddH2O為模板。表達(dá)量采用相對(duì)定量2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.2.4 SOD、CAT、POD活性及MDA含量的測(cè)定 參照高俊鳳的方法進(jìn)行CAT、SOD、POD活性和MDA含量的測(cè)定，均為鮮質(zhì)量活性或含量[14]。

1.2.5 zma-miR059 STTM表達(dá)載體的構(gòu)建 zma-miR059的序列為5′-ATCATGGCAGTGAGATCGTCG-3′，參照Yan等的方法[15]設(shè)計(jì)zma-miR059的STTM序列，整段序列如下：5′-CATTTGGAGAGGACAGCCCCGACGATCTCATAGCTG CCATGATGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTA AAGAAGAAGAATCGACGATCTCATAGCTGCCATGATGGTACG CTGAAATCACCAG-3′。根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建STTM-zma-miR059表達(dá)載體，引物序列詳見(jiàn)表2。

表2 構(gòu)建STTM-zma-miR059的引物

以pOT2-Poly-Cis質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增STTM(KOD-Plus-Neo，日本)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化[天根生化科技(北京)有限公司]，用Swa[New England Biolabs(NEB)公司，美國(guó)]酶切產(chǎn)物，4 ℃過(guò)夜自連，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技(北京)有限公司]，用卡那霉素(Kan)篩選，選擇陽(yáng)性菌落以STTM-F、STTM-R為引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，進(jìn)行BLAST比對(duì)。

以連接成功的pOT2-STTM為模板，PCR刪除復(fù)制起始位點(diǎn)，將產(chǎn)物回收純化，用PacI[New England Biolabs(NEB)公司，美國(guó)]酶切pFGC5941-PacI和PCR片段，為了防止載體自連，用pFGC5941-PacI酶切120 min后再在體系中加入1 μL堿性磷酸酶(NEB，USA)處理30 min，純化，4 ℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組載體pFGC5941-STTM，選擇陽(yáng)性菌落，以STTM-F、STTM-R為引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，進(jìn)行BLAST比對(duì)。測(cè)序驗(yàn)證正確后用液氮速凍法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對(duì)zma-miR059表達(dá)的影響

由圖1可以看出，NaCl脅迫下玉米葉片、根系中的zma-miR059表達(dá)量均明顯上升。全根NaCl處理下，葉片表達(dá)量是對(duì)照葉的3.71倍，根系表達(dá)量是對(duì)照根系的3.75倍。zma-miR059在分根NaCl處理下的葉片和鹽處理側(cè)根系中的表達(dá)水平也上升，但沒(méi)有全根NaCl脅迫下的上升明顯。分根NaCl處理組葉片的表達(dá)量比對(duì)照葉片上調(diào)了120%，鹽處理側(cè)根系的表達(dá)量比對(duì)照根系上調(diào)了85%，水處理側(cè)根系的表達(dá)量與對(duì)照根系相當(dāng)。結(jié)果顯示，在NaCl脅迫下zma-miR059的表達(dá)量明顯上升，與前期高通量測(cè)序結(jié)果一致，進(jìn)一步表明zma-miR059是一個(gè)新的與NaCl脅迫相關(guān)的miRNA。

2.2 NaCl處理對(duì)玉米SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影響

如圖2-A所示，用NaCl處理后，玉米幼苗的葉片和根系中SOD活性均有所提高。NaCl處理對(duì)葉片中SOD活性的影響比對(duì)根系中SOD活性的影響更大；SOD活性在對(duì)照、分根NaCl處理和全根NaCl處理葉片中呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，且在全根NaCl處理的玉米葉片中SOD活性達(dá)到最大值；處理組根系中的SOD活性雖然也增加了，但沒(méi)有葉片增加得明顯。

NaCl處理能夠在一定水平上影響幼苗的POD活性。如圖2-B所示，NaCl處理后，葉片中的POD活性變化并不明顯，其中分根NaCl處理呈現(xiàn)出微小的下降趨勢(shì)。但是全根、分根NaCl處理的幼苗根系中POD活性均增加。

如圖2-C所示，與POD、SOD的活性變化不同，NaCl處理后玉米幼苗根系和葉片中的CAT活性明顯降低，特別是在全根NaCl處理的玉米幼苗中，CAT活性在其葉片中有明顯降低，這與鄭世英等的研究結(jié)果一致[16]。

如圖2-D所示，NaCl處理對(duì)玉米幼苗的葉片和根系中MDA含量影響明顯，全根NaCl處理的葉片中MDA含量是對(duì)照葉片中的4.25倍，分根NaCl處理的葉片中MDA含量是對(duì)照的2.06倍。全根NaCl處理的根系中MDA含量增加了 2.91 倍，分根處理的根系中MDA含量增加了2.01倍。經(jīng)NaCl處理后，MDA含量在玉米幼苗葉片和根系的對(duì)照組、分根NaCl處理組及全根NaCl處理組中均呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)。

2.3 zma-miR059-STTM表達(dá)載體的構(gòu)建

按照第“1.2.5”節(jié)中描述的方法進(jìn)行載體構(gòu)建，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR或酶切鑒定，鑒定正確后通過(guò)測(cè)序最終確定STTM的序列。由圖3可以看出，1、2、3泳道檢測(cè)到的菌落PCR片段大小為134 bp，與預(yù)期大小一致，表明連接成功。由圖4可以看出，酶切片段為刪除pOT2-STTM復(fù)制起始位點(diǎn)的PCR片段，大小為2 837 bp，與PCR片段一樣，說(shuō)明 pFGC5941-STTM重組質(zhì)粒連接成功。測(cè)序比對(duì)后顯示序列正確，表明zma-miR059-STTM的表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

miRNA以調(diào)控靶標(biāo)的方式在轉(zhuǎn)錄后水平參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[17]。Ding等研究發(fā)現(xiàn)，用鹽處理玉米根系時(shí)，miR166、miR319、miR395、miR399等表達(dá)水平顯著改變[5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，用NaCl處理玉米幼苗時(shí)，葉片、根系的 zma-miR059表達(dá)量均升高，表明zma-miR059可能是玉米抗鹽性相關(guān)的miRNA。此外，分根處理的玉米幼苗葉片和根系中zma-miR059的表達(dá)量低于全根NaCl處理，表明分根處理能夠在一定程度上緩解玉米的脅迫情況，從而影響 zma-miR059的表達(dá)量。

植物體內(nèi)的SOD、CAT和POD等抗氧化酶是檢測(cè)活性氧代謝的生物標(biāo)志物[18-20]，MDA在植物受到傷害后產(chǎn)生，植物受外界脅迫越強(qiáng)，MDA含量越高[12，21-22]，因此MDA含量及保護(hù)酶活性可以用來(lái)評(píng)判植物對(duì)外界脅迫的抵抗能力。全根NaCl處理和分根NaCl處理后，玉米幼苗葉片、根系中的SOD、POD活性均增加，表明NaCl脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化、活性氧積累，而SOD等保護(hù)酶活性的增強(qiáng)可以有效清除活性氧，提高對(duì)脅迫的抵御能力。分根NaCl處理的玉米幼苗酶活性增加程度明顯低于全根NaCl處理，表明在NaCl濃度相同時(shí)，分根NaCl處理的膜脂過(guò)氧化程度低于全根NaCl脅迫，分根處理會(huì)在一定程度上緩解植物的膜脂過(guò)氧化水平。NaCl處理后，玉米幼苗的葉片、根系中MDA含量明顯增加，分根NaCl處理的玉米幼苗中MDA含量均低于全根NaCl處理，因此可見(jiàn)全根NaCl處理比分根NaCl處理會(huì)更大程度地?fù)p害植物膜系統(tǒng)。zma-miR059在根中的表達(dá)量變化趨勢(shì)與MDA含量、POD活性變化趨勢(shì)基本相同，都是脅迫后上升，且全根NaCl處理比分根處理增加幅度更大，進(jìn)一步說(shuō)明 zma-miR059 與玉米抵抗鹽脅迫相關(guān)。

Yan等構(gòu)建miR165/166的STTM載體侵染擬南芥后，出現(xiàn)了植株葉片不規(guī)則、矮小、彎曲的表型[15]，與FranCo-Zorrilla等構(gòu)建的TM載體[23]相比，Yan等構(gòu)建的突變體沉默效率更高[15]。本試驗(yàn)表明，zma-miR059是1個(gè)與玉米鹽脅迫相關(guān)的miRNA，為了進(jìn)一步研究zma-miR059的作用機(jī)制，揭示其功能，筆者構(gòu)建了STTM載體，并進(jìn)行了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，下一步將獲得STTM-zma-miR059轉(zhuǎn)基因玉米，期望通過(guò)轉(zhuǎn)基因玉米試驗(yàn)進(jìn)一步明確zma-miR059與抗鹽性的關(guān)系。