江蘇省小麥新品系赤霉病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

常 蕾， 張 瑜， 曲若端， 張 勇， 陳懷谷， 馬鴻翔， 張 旭

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院泰州農(nóng)科所，江蘇泰州 225300；3.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225007； 4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，簡(jiǎn)稱FHB)是一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的小麥病害，包括江蘇省在內(nèi)的長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)是小麥赤霉病的多發(fā)區(qū)和重發(fā)區(qū)[1]。2012年赤霉病大流行中，山東、河南、安徽和江蘇等地小麥主產(chǎn)區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，部分地區(qū)產(chǎn)量損失高達(dá)301.5～1 877.3 kg/hm2[2]。通過耕作制度和栽培方式的改變難以從根本上消除病害的蔓延和危害。化學(xué)藥劑防治的手段不僅會(huì)增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，降低小麥生產(chǎn)效益，還會(huì)不可避免地造成農(nóng)業(yè)環(huán)境污染[3]。因此，尋找小麥赤霉病抗源并進(jìn)行抗性改良是減輕小麥赤霉病危害最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的有效途徑。

多年實(shí)踐證明，小麥品種對(duì)赤霉病的主要抗性為抗初侵染(resistance to initial infection，簡(jiǎn)稱type Ⅰ)、抗擴(kuò)展(resistance to spread，簡(jiǎn)稱type Ⅱ)和抗毒素積累(resistance to toxin accumulation，簡(jiǎn)稱type Ⅲ)等多種類型[4-5]。小麥赤霉病抗性評(píng)價(jià)須在開花至抽穗期進(jìn)行，表型鑒定不僅易受環(huán)境條件影響，而且難以獲得穩(wěn)定可靠的抗性后代，同時(shí)，赤霉病抗性為多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳機(jī)制復(fù)雜而不明確，從而進(jìn)一步制約了小麥赤霉病抗性的遺傳改良。利用分子標(biāo)記技術(shù)能有效克服基因型鑒定的困難，有助于赤霉病抗性的表型鑒定，提高育種效率[6-7]。目前在小麥的21條染色體上均找到了與赤霉病抗性相關(guān)的數(shù)量性狀基因(quantitative trait locus，簡(jiǎn)稱QTL)，其中染色體3BS上的抗擴(kuò)展QTLFhb1效應(yīng)較大且穩(wěn)定，對(duì)赤霉病抗性的貢獻(xiàn)最大[8]，側(cè)翼緊密連鎖的簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR)標(biāo)記基因位點(diǎn)Xgwm533和基因診斷型標(biāo)記基因位點(diǎn)JAAS01可用于該基因的分子標(biāo)記輔助選擇，已有研究報(bào)道赤霉病抗性基因Fhb1被成功轉(zhuǎn)入小麥感病品系中并提高了該感病品系的抗性[9]。

禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)是引起小麥赤霉病的主要病原菌，其次生代謝產(chǎn)物如真菌毒素[在我國(guó)主要為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON)]還會(huì)威脅人類和家畜的健康[10]，成為小麥增產(chǎn)與質(zhì)量安全的主要威脅，尤其對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃淮流域等重要冬麥區(qū)構(gòu)成重大威脅[11]。DON毒素積累抗性已成為育種家培育赤霉病抗性品種關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前DON的檢測(cè)方法主要包括薄層色譜法[12]、高效液相色譜法[13]、氣相色譜法[14]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[15](enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA)等。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法具有選擇性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用較多的快速檢測(cè)DON的方法[16]。

目前，國(guó)內(nèi)所使用的小麥赤霉病抗源往往局限于少數(shù)幾個(gè)親本，如蘇麥3號(hào)、望水白、寧7840等，因而開拓新的抗源已成為當(dāng)務(wù)之急[10]。為了尋找和篩選抗性好的小麥材料，首先應(yīng)進(jìn)行小麥種質(zhì)資源對(duì)赤霉病抗性的鑒定和評(píng)價(jià)。本研究采用單花滴注法對(duì)江蘇省各單位提供的97份小麥品系的赤霉病抗性水平進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抗擴(kuò)展性及低毒素積累抗性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期全面了解江蘇小麥品種抗赤霉病的現(xiàn)狀水平，為今后更好地進(jìn)行小麥抗赤霉病育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為97份小麥高代品系，由江蘇省各主要育種單位提供(表1)，對(duì)照品種蘇麥3號(hào)和安農(nóng)8455由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。供試菌株為試驗(yàn)當(dāng)?shù)貜?qiáng)致病力亞細(xì)亞鐮刀菌菌株F0609，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

表1 江蘇省各育種單位提供的小麥品系

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)分別在南京市主城區(qū)(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京主城)、南京市六合區(qū)(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，南京六合)及揚(yáng)州市(江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，揚(yáng)州)3地赤霉病病圃內(nèi)進(jìn)行。

1.3 赤霉病抗性鑒定與抗病性評(píng)價(jià)指標(biāo)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，每個(gè)小區(qū)內(nèi)參試品系按行播種，行長(zhǎng)1.5 m，行距25.0 cm，每行播種50～80粒。小麥揚(yáng)花初期(2015年4月10—22日)，采用單花滴注法將分生孢子液(5×105個(gè)/mL)滴注到揚(yáng)花初期麥穗中部的1個(gè)小花中，每品種10穗，塑料袋套袋保濕3 d后，噴水霧3～4次/d，每次5 min左右，以達(dá)到保濕效果。

對(duì)南京六合病圃及揚(yáng)州病圃試驗(yàn)材料進(jìn)行病小穗數(shù)調(diào)查：接種后21 d調(diào)查接種麥穗的病小穗數(shù)。

對(duì)南京主城病圃材料進(jìn)行嚴(yán)重度調(diào)查：接種后30 d調(diào)查病情發(fā)生情況，計(jì)算平均反應(yīng)級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)，接種小穗發(fā)病，穗軸不發(fā)病；2級(jí)，穗軸發(fā)病，但發(fā)病小穗數(shù)小于等于全穗的1/4；3級(jí)，發(fā)病小穗數(shù)大于全穗的1/4且小于等于全穗的1/2；4級(jí)，發(fā)病小穗數(shù)占全穗的1/2以上。

抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：抗(resistance，簡(jiǎn)稱R)，平均病小穗數(shù)≤2.00，平均嚴(yán)重度<1.40；中抗(moderate resistance，簡(jiǎn)稱MR)，2.00<平均病小穗數(shù)≤4.00，1.40≤平均嚴(yán)重度<2.70；中感(moderate susceptibility，簡(jiǎn)稱MS)，4.00<平均病小穗數(shù)≤6.00，2.70≤平均嚴(yán)重度<3.50；感(susceptibility，簡(jiǎn)稱S)，平均病小穗數(shù)>6.00，平均嚴(yán)重度≥3.50。

1.4 抗性基因標(biāo)記鑒定

1.4.1 DNA提取與引物的合成 剪取小麥葉片，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)[17]法提取樣品DNA，采用引物gwm533和JAAS01進(jìn)行抗性基因鑒定。引物序列為gwm533F：5′-AAGGCGAATCAAACGGAATA-3′，gwm533R：5′-GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC-3′；JAAS01F：5′-GTTCC-ACGTCTTCTTACATAATCCC-3′，JAAS01R：5′-TGAAGTTC-ATGCCACGCATA-3′。

1.4.2 SSR檢測(cè) PCR反應(yīng)體積為10 μL。反應(yīng)混合液包括10×buffer(含MgCl2)1 μL，10 mmol/L dNTPs 0.8 μL，2.5 μmol/L 引物1.0 μL，50～100 ng模板DNA 3.0 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。gwm533擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色成像；JAAS01擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，熒光染料溴化乙錠染色成像。

1.5 DON含量測(cè)定

采用北京華安麥科生物技術(shù)有限公司提供的嘔吐毒素(DON)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)籽粒中的DON含量，檢測(cè)方法參照試劑盒說明書。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2007分析標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品系的赤霉病抗性鑒定

由表2可知，2014—2015年度，對(duì)照蘇麥3號(hào)在南京六合、揚(yáng)州的試驗(yàn)中病小穗數(shù)分別為1.60、1.10，在南京主城區(qū)試驗(yàn)中嚴(yán)重度為 1.32，表現(xiàn)為抗赤霉??；安農(nóng)8455的病小穗數(shù)分別為20.00和16.10，嚴(yán)重度為3.55，表現(xiàn)為感赤霉病，說明本年度抗性鑒定各點(diǎn)次試驗(yàn)均為有效試驗(yàn)。

表2 2014—2015年97份小麥新品系的病情調(diào)查

56個(gè)淮北品系的病小穗數(shù)分布范圍為1.83～19.50，沒有品系達(dá)到抗病水平。由表3可知，有2個(gè)品系(瑞華14406和淮麥1403)在3地的試驗(yàn)中均達(dá)到中抗(MR)水平，有3個(gè)品系(瑞華1408、淮麥12456和淮麥12514)在3地的試驗(yàn)中均達(dá)到中感(MS)及以上水平。41個(gè)淮南品系的病小穗數(shù)分布范圍為1.00～8.98。由表4可知，其中有15個(gè)品系在3地的試驗(yàn)中均達(dá)到中抗(MR)及以上水平。結(jié)果表明，淮南小麥品系赤霉病抗性明顯優(yōu)于淮北小麥品系。

2.2 小麥品系抗性基因的標(biāo)記診斷鑒定

由表5可知，對(duì)97份材料進(jìn)行赤霉病抗性基因Fhb1的標(biāo)記診斷鑒定，有6個(gè)品系攜有標(biāo)記JAAS01，且均為淮南品系，其在南京六合和揚(yáng)州的平均病小穗數(shù)分別為3.34、2.12；有19個(gè)品系攜有Xgwm533標(biāo)記，其中17個(gè)品系為淮南品系，其在南京六合的平均病小穗數(shù)也低于淮南品種平均病小穗數(shù)。結(jié)果表明，攜有Fhb1抗性位點(diǎn)的小麥品系赤霉病抗性水平明顯提高。

表3 部分淮北小麥品系赤霉病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

2.3 小麥籽粒DON毒素積累抗性檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，接種赤霉病病菌后淮北小麥品系籽粒的毒素含量范圍為1.32～52.88 μg/g，淮南小麥品系籽粒的毒素含量范圍為 0.70～19.03 μg/g， 淮南小麥品系的低毒素積累抗性明顯優(yōu)于淮北小麥品系(表2)。所有小麥品系只有15YZSC10的毒素含量達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2761—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》)；另有10份小麥品系的籽粒中DON毒素含量低于2.00 μg/g，表明人工接種后江蘇省小麥品系籽粒DON毒素含量較高，低毒素積累抗性較低，低毒素積累抗性是今后江蘇省小麥赤霉病抗性育種所需解決的重點(diǎn)難題。

表4 部分淮南小麥品系赤霉病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

表5 抗性基因Fhb1的標(biāo)記診斷結(jié)果

注：“*”表示供試小麥材料攜帶抗性位點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

在已審定的江蘇省小麥品種中，不同麥區(qū)的品種赤霉病抗性差異較大，淮北小麥品種多為感病品種，淮南小麥品種多為中抗以上水平。本研究對(duì)江蘇省各單位提供的97份小麥新育成品系進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)中抗及以上水平的小麥品系，其中品系ZX7007和15YZSC05可作為赤霉病抗性親本應(yīng)用到育種中。但在赤霉病中抗以上品系中只有2個(gè)為淮北品系(瑞華14406和淮麥1403)，其余均為淮南品系，表明淮南小麥品系的赤霉病抗性明顯優(yōu)于淮北小麥品系，因此提高淮北小麥品種的赤霉病抗性對(duì)江蘇省小麥抗赤霉病育種至關(guān)重要。

Fhb1是小麥3BS染色體上的抗擴(kuò)展QTL，對(duì)赤霉病的抗性貢獻(xiàn)大。美國(guó)已育成一些攜有Fhb1基因的商業(yè)軟粒小麥品種[18]。本研究對(duì)所有小麥試驗(yàn)品系進(jìn)行赤霉病抗性基因Fhb1的JAAS01標(biāo)記診斷鑒定，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)品系含有Fhb1抗性位點(diǎn)，且赤霉病抗性水平都相對(duì)較高，表明Fhb1基因有助于提高小麥赤霉病抗性，今后可以利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)育至感病的小麥商業(yè)化品種中，以提高小麥赤霉病發(fā)病率。

研究表明，DON可以干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻礙核糖體循環(huán)，抑制蛋白質(zhì)的合成，引起免疫功能障礙和繁殖功能障礙等癥狀[11]。本研究檢測(cè)的97份小麥品系在接種赤霉病菌后，只有11份小麥品系的籽粒中DON毒素含量低于2 μg/g，表明江蘇省小麥籽粒DON毒素含量較高。目前尚沒有單一措施可以徹底解決鐮刀菌毒素的污染難題。赤霉病的綜合治理技術(shù)包括選擇抗病品種、殺菌劑噴霧、作物輪作以及耕翻等。因此，培育抗赤霉病、籽粒低DON含量的品種是控制赤霉病、減輕DON危害最為經(jīng)濟(jì)有效且對(duì)環(huán)境友好的途徑。