與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl連鎖的標(biāo)記及應(yīng)用

劉 蕾， 王 輝， 李文麗， 王 富

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109)

番茄頸腐根腐病(Fusariumcrown and root rot，簡稱FCRR)于1974年首次在日本被發(fā)現(xiàn)[1]，之后于1976年在美國南部被發(fā)現(xiàn)[2]。目前此病害已對美國、日本、加拿大、墨西哥、以色列、韓國以及歐洲等許多國家和地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成重大損失[3-7]。最近幾年，該病在我國華北、東北地區(qū)發(fā)病較重，其中山東省最早于2010年在壽光市發(fā)現(xiàn)該病，隨后逐漸蔓延至全省各地。當(dāng)前，此病害已經(jīng)嚴(yán)重威脅到山東省溫室大棚冬春季番茄生產(chǎn)[8]。

引發(fā)番茄頸腐根腐病的病原菌主要是尖孢鐮刀菌番茄頸腐根腐?；?Fusariumoxysporumf. sp.radicis-lycopersici，簡稱FORL)，此病侵染周期相對較長，番茄一旦感染，目前還沒有十分安全有效的治療方法[9]，所以對于該病害最科學(xué)的防治方法就是選育抗番茄頸腐根腐病的新品種。已有研究結(jié)果表明，番茄頸腐根腐病抗病性遺傳是由顯性單基因Frl控制的[10]，并且3份抗源材料中的抗病基因均為同一種基因[11]，3份番茄頸腐根腐病抗源材料都是源自野生番茄Solanumperuvianum(PI126944、PI128650和PI126926)，已有研究者將其中的抗病基因轉(zhuǎn)入栽培番茄中[12]，抗病基因Frl已被定位到9號染色體上[10，13]。

本研究利用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl連鎖的分子標(biāo)記SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中進行驗證[14-15]，進而在F1代抗病材料自交后代群體中進行分子標(biāo)記輔助篩選，結(jié)合接種鑒定結(jié)果評價該標(biāo)記的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗材料包括已知抗病材料P1、感病材料P2及其雜交1代，抗病F1代商品品種凱文及F2代群體材料共24株(分別編號為1～24)。

1.2 方法

1.2.1 番茄樣品DNA的提取純化及檢測 采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)法提取試驗材料的DNA并進行純化，設(shè)計出合適的引物對番茄材料DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳及成像技術(shù)顯示DNA條帶并觀察分析。

1.2.2 引物合成 與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的共顯性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence，即酶切擴增多態(tài)性序列)標(biāo)記C2-25由Staniaszek等設(shè)計[14]，SCAR200由Mutlu等設(shè)計[15]。引物序列交給生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助合成。

1.2.3 PCR擴增反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：模板DNA(20～80 ng/μL)4.0 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 μL，引物F/R(10 μmol/L)各1.0 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)2.5 μL，加ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s(SCAR200)或57 ℃退火40 s(C2-25)，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取PCR擴增產(chǎn)物約 10 μL，在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR擴增結(jié)果，用自動凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，記錄電泳結(jié)果。

1.2.4 酶切方法 使用限制性內(nèi)切酶XapⅠ在37 ℃下將擴增產(chǎn)物酶切3 h，酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物5.0 μL、Buffer 1.5 μL、XapⅠ 0.3 μL，加ddH2O補足至15 μL。37 ℃酶切 2 h，取酶切產(chǎn)物5 μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用自動凝膠成像系統(tǒng)觀察照相，記錄結(jié)果。

1.2.5 番茄抗病材料的接種鑒定 將病原菌進行搖菌培養(yǎng)，25 ℃、150 r/min振蕩5 d，用3層紗布過濾除去菌絲并離心收集沉淀，將沉淀稀釋成107個/mL，將生長至1張真葉期的番茄根洗凈并將主根剪出傷口，浸泡在孢子懸浮液中15 min，并設(shè)置感病材料作為對照，置于18 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2周后觀察發(fā)病癥狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCAR200和C2-25在P1、P2、F1代及凱文中的驗證

選用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標(biāo)記SCAR200和C2-25，分別在抗病材料P1、感病材料P2、F1代及商品種凱文中進行PCR檢測。由圖1、圖2可知，SCAR200在抗病材料P1中可擴增出290 bp左右的特異DNA條帶，在感病材料 P2中可擴增出310 bp的目的條帶， 在F1代和凱文中均可擴增出290、310 bp 2條特征譜帶，可見SCAR200為共顯性標(biāo)記，可用于已知抗、感材料的分子標(biāo)記輔助鑒定。

CAPS標(biāo)記C2-25在抗病材料P1中的酶切產(chǎn)物存在700 bp 左右的特異DNA條帶， 在感病材料P2中的酶切產(chǎn)物存在1 000 bp的目的條帶，在F1代和凱文中均同時存在700、1 000 bp 2條特征譜帶，可見該標(biāo)記可以用于已知抗、感材料的分子標(biāo)記輔助鑒定。

2.2 SCAR200和C2-25在凱文F2代群體單株中的檢測

對與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標(biāo)記SCAR200和C2-25分別在凱文F2代群體中進行分子檢測，由圖3、圖4可知，F(xiàn)2代群體24個單株中有7個單株(編號分別為1、13、15、17、19、20、21)在SCAR200和C2-25檢測中為純合抗病單株；有5個單株(編號分別為5、10、12、16、22)為感病單株；其余12個單株(編號分別為2、3、4、6、7、8、9、11、14、18、23、24)為雜合抗病單株。

2.3 凱文F2代群體抗病接種鑒定結(jié)果

對24份未知抗病性的番茄單株進行人工接種頸腐根腐病病原菌鑒定，由表1可知，6個單株(編號分別為5、10、12、16、22、24)表現(xiàn)為感病，主根和莖基部都出現(xiàn)萎縮變褐現(xiàn)象，并且株高較小，根的長度也明顯短于未發(fā)病植株；其他植株根和莖基部均表現(xiàn)正常，表現(xiàn)為抗病。

圖3、圖4的分子標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，有5個單株(編號分別為5、10、12、16、22)為感病單株，與接種鑒定結(jié)果相比，僅有1個單株(編號為24)在分子鑒定過程中顯示為抗病，而在接種鑒定結(jié)果中顯示為感病，可見分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率為95.83%。

3 結(jié)論與討論

近年來有研究表明，分子標(biāo)記SCAR200在純合抗番茄頸腐根腐病材料中存在290 bp的特異譜帶，在感病材料中存在310 bp的特異譜帶，在雜合抗病材料中存在290、310 bp的條帶；CAPS標(biāo)記C2-25在純合抗番茄頸腐根腐病材料中存在700 bp的特異譜帶，在感病材料中存在1 000 bp的特異譜帶，在雜合抗病材料中存在700、1 000 bp的條帶[14-15]。

表1 凱文F2代群體抗病接種鑒定結(jié)果

注：R、S分別表示抗病、感病。

本研究利用與番茄頸腐根腐病抗病基因Frl緊密連鎖的分子標(biāo)記SCAR200和C2-25在已知抗病和感病材料中進行驗證，進而結(jié)合接種鑒定方法在抗病商品種凱文F2代群體中加以應(yīng)用。結(jié)果顯示，SCAR200和C2-25均為共顯性標(biāo)記，可以用于已知抗病和感病材料中的分子標(biāo)記輔助鑒定；SCAR200和C2-25在凱文F2代群體24個單株中均檢測到7個純合抗病單株、5個感病單株和12個雜合抗病單株；接種鑒定結(jié)果顯示，有1個單株與分子鑒定結(jié)果存在出入，即分子標(biāo)記輔助鑒定的準(zhǔn)確率為95.83%。

本試驗中有1個單株接種鑒定結(jié)果表現(xiàn)為感病，而分子標(biāo)記檢測結(jié)果為抗病，這種差異可能與2個分子標(biāo)記與抗病基因Frl間尚存在一定的連鎖距離有關(guān)，因此后續(xù)研究可開發(fā)與抗病基因Frl連鎖關(guān)系更近乃至基因特異標(biāo)記，從而提高分子標(biāo)記鑒定的準(zhǔn)確度。