張 萍， 馬 鑫， 王 濤， 游 玲，2， 魏 琴，2

(1.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓 644000； 2.香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000)

植物生長的生態(tài)環(huán)境為內(nèi)生菌的主要來源，已有大量研究揭示了其對植物內(nèi)生菌的重要影響，如汪立群等用分離培養(yǎng)的方法，發(fā)現(xiàn)安徽的紫娟、云抗10號2種茶樹的內(nèi)生菌優(yōu)勢種屬與季愛兵采用云南生長的同一品種樣品得到的優(yōu)勢種屬不一致[1-2]，說明不同生態(tài)環(huán)境中的同品種植物內(nèi)生菌構(gòu)成存在明顯差異。王海采用PCR-DGGE和DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)相同產(chǎn)地川芎的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)相似程度較高，不同產(chǎn)地間的相似程度較低[3]。近年來，高通量測序技術(shù)成為微生物區(qū)系研究的主要方法[4]，在植物內(nèi)生菌研究領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用，證實(shí)環(huán)境對植物內(nèi)生菌區(qū)系分布的影響比我們認(rèn)識的更加重要。如Hong等發(fā)現(xiàn)九龍河口的多種濕地植物有著相似的優(yōu)勢內(nèi)生菌[5]。馬昭采用高通量測序及純培養(yǎng)相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛內(nèi)生菌的生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)有別于人工栽培種，且各產(chǎn)地野生種鐵皮石斛表現(xiàn)出各自獨(dú)特的內(nèi)生菌種群分布和群落結(jié)構(gòu)特征[6]。趙維殳等也發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地魚腥草內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)間有著明顯的差異[7]。

油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H. W. Li.]屬樟科(Lauraceae)，為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，主要用于樟油生產(chǎn)，四川宜賓為油樟的主產(chǎn)區(qū)，其枝葉中所含揮發(fā)油成分與其他產(chǎn)地的油樟有明顯差異[8]，已經(jīng)證實(shí)這些揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的形成與其內(nèi)生真菌有關(guān)[9]，表明油樟內(nèi)生菌與宿主之間存在緊密聯(lián)系。在野外調(diào)查中，筆者發(fā)現(xiàn)四川省宜賓縣隆興鄉(xiāng)的油樟母本園的部分植株上著生有寄生植物，其枝葉完全沒有油樟油特有的氣味，由于該寄生植物與油樟生長環(huán)境、營養(yǎng)條件完全相同，僅植物基因型不一致，可作為研究宿主遺傳特性(及其表型)對內(nèi)生菌分布的影響的一種模型。因此本研究以油樟、油樟寄生植物及同一生長環(huán)境的喬木桂花為研究對象，探討植物生長環(huán)境及遺傳特性對內(nèi)生菌區(qū)系分布的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

油樟、油樟寄生植物和桂花葉片均采自四川省宜賓縣隆興鄉(xiāng)油樟母樹繁育基地，基地地形為丘陵山地，面積21.67 hm2，林內(nèi)均為胸徑10～20 cm的油樟樹，林下環(huán)境潮濕蔭蔽，地面苔蘚密集，植物種屬較少，無其他喬木，僅邊緣有桂花樹零星分布。林中部分油樟樹冠上著生有喬木類寄生植物，經(jīng)查閱《中國植物志》[10]，并與四川大學(xué)植物標(biāo)本館中的相關(guān)植物標(biāo)本比較，將油樟的寄生植物鑒定為桑寄生[Taxillussutchuenensis(Lecomte) Danser]。

采樣地點(diǎn)海拔358.3 m，經(jīng)度104.45°，緯度20.02°，時(shí)間為2016年1月下旬，采樣時(shí)葉片處于生長完全階段，少幼葉，按照多點(diǎn)采樣方式，在油樟母本園方圓約200 m2范圍里，分別選取3株長有桑寄生、無明顯病蟲害、胸徑約15 cm油樟樹及相鄰50 m左右的3株桂花樹，采集3種植物不同朝向、不同高度的葉片，分別混勻，馬上送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 方法

1.2.1 葉片表面消毒 將剛剛采集的葉片用清水沖洗1 min使泥土洗凈后，自然風(fēng)干。75%乙醇浸泡60 s，后用無菌水沖洗葉片表面至少6次，最后1次無菌水取200 μL涂布PDA固體培養(yǎng)基，于28 ℃下培養(yǎng)，3～5 d內(nèi)每天定時(shí)查看是否長菌。

1.2.2 提取葉片總DNA 采用Omega試劑盒提取葉片總DNA，按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)增引物為338F(ACTCCTA-CGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAA-T)[11]，內(nèi)生真菌引物為ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAGT-AA)和2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[12]。PCR反應(yīng)體系為25 μL，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用3 μL上樣、2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina平臺測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 過濾尾部質(zhì)量值20以下的堿基及質(zhì)控后50 bp以下的序列，再拼接，按最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列，對優(yōu)化后的序列提取非重復(fù)序列，利用Usearch(vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/)軟件平臺，按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，并繪制熱圖。利用silva數(shù)據(jù)庫鑒定細(xì)菌種屬[13]，利用Unite數(shù)據(jù)庫鑒定真菌種屬[14]，利用Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，分別計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)(Simpson)和物種豐富度指數(shù)(ACE)[15]，利用R軟件制作Venn圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列質(zhì)量分析

對細(xì)菌3個(gè)樣品共測得序列120 401條，其平均序列長度為429 bp，其中420～460 bp的序列占99.97%，真菌 131 058 條，其平均序列長度為278 bp，其序列長度分布如圖1所示。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌區(qū)系分布差異

從表1可以看出，油樟葉內(nèi)生細(xì)菌的多樣性最大，桑寄生次之，桂花最少。總體上，油樟葉片中內(nèi)生細(xì)菌種類豐富，菌群結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，桂花葉片中雖有效序列條數(shù)最多，但菌群種類單一，菌群穩(wěn)定性較差。

表1 3種植物葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性比較

注：“GH”表示桂花，“JS”表示桑寄生，“YZJS”表示長有桑寄生的油樟。下同。

排除線粒體DNA，在屬一級水平上，桂花內(nèi)生細(xì)菌豐度大于1%的屬有芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、Faecalibacterium、乳球菌屬(Lactococcus)、嗜堿菌屬(Alkaliphilus)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)，其豐度分別為 8.02%、3.37%、3.37%、2.03%、1.39%、1.09%，其他豐度小于1%的種屬合計(jì)共占3.17%。油樟內(nèi)生細(xì)菌豐度大于1%的屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)下一個(gè)未鑒定屬、 類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)，其豐度分布為40.19%、16.20%、11.89%、5.68%、4.42%、1.54%、1.38%，其他豐度小于1%的種屬合計(jì)共占3.37%。桑寄生內(nèi)生細(xì)菌豐度大于1%的屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Alkaliphilus、Enterobacteriaceae科下一個(gè)未鑒定屬，其豐度分別為14.72%、5.46%、3.81%、1.72%、1.61%，其他相對豐度小于1%的種屬合計(jì)共占1.8%。

從圖2可以看出，油樟、桑寄生、桂花3種植物共有的細(xì)菌屬有17個(gè)，獨(dú)有的屬分別僅有7個(gè)、1個(gè)、4個(gè)，表明3種植物的內(nèi)生菌主要來源于環(huán)境，獨(dú)有的這些屬與這3種植物的遺傳特性有關(guān)。有2個(gè)屬僅在油樟、桑寄生中分布，表明這2個(gè)屬與油樟、桑寄生相同的營養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。

從圖3可以看出，生長環(huán)境相同的桂花、油樟和桑寄生葉內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種屬(相對豐度>1%)的構(gòu)成及豐度不完全相同。與寄主植物油樟相比，桑寄生葉及桂花葉內(nèi)生細(xì)菌的種屬構(gòu)成更為相似，除Pseudobutyrivibrio、Faecalibacterium、念珠菌屬(Candidatus)僅在桂花葉內(nèi)分布，莫拉氏菌屬(Moraxella)僅在桑寄生葉內(nèi)分布外， 其余各屬在2種植物內(nèi)的分布差異僅體現(xiàn)在豐度上，且梭菌屬(Clostridium)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、Bacillus等優(yōu)勢屬在桑寄生葉及桂花葉內(nèi)的分布及豐度相似，但與桑寄生葉內(nèi)生細(xì)菌相比，Candidatus僅分布于油樟葉內(nèi)，Bacillus、Clostridium、Geobacillus、Lactococcus、Enterococcus在油樟葉內(nèi)生細(xì)菌中的豐度也明顯高于桑寄生，桑寄生與油樟葉內(nèi)生細(xì)菌區(qū)系構(gòu)成差異明顯高于桑寄生與桂花。說明在相同環(huán)境背景下，植物內(nèi)生細(xì)菌種屬構(gòu)成非常相似，但植物遺傳特性對不同植物內(nèi)生細(xì)菌的分布仍有2個(gè)方面的主要影響，一是不同植物內(nèi)生細(xì)菌各種屬的相對豐度不同，二是不同植物對某些種屬細(xì)菌具有選擇性。并且，相同的大環(huán)境及營養(yǎng)環(huán)境不能使油樟及其寄生植物擁有完全相同的內(nèi)生細(xì)菌?？紤]到寄主及寄生植物結(jié)構(gòu)相互聯(lián)通，內(nèi)生細(xì)菌可自由遷移，有差異的種屬來自種子垂直傳播的可能性較小，更主要的原因可能在于植物遺傳特性導(dǎo)致的葉內(nèi)代謝產(chǎn)物不同， 而這些代謝產(chǎn)物在不同程度上調(diào)控著各種屬內(nèi)生細(xì)菌的生長。

2.2 內(nèi)生真菌區(qū)系分布差異

從表2可以看出，油樟及桑寄生內(nèi)生真菌的多樣性明顯高于桂花，其群落結(jié)構(gòu)也更穩(wěn)定。在屬一級分類水平上，桂花內(nèi)生真菌測得序列數(shù)量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、未鑒定屬、煤炱目(Capnodiales)下一個(gè)未鑒定屬、鐮刀霉屬(Fusarium)、類擔(dān)子菌酵母屬(Derxomyces)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)下一個(gè)未鑒定屬、瓶霉屬(Phialophora)，其豐度分別為68.83%、6.61%、5.50%、5.48%、2.66%、2.24%、1.38%，測得序列條數(shù)少于500條的其他種屬合計(jì)共占7.3%。油樟內(nèi)生真菌測得序列數(shù)量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、Mycosphaerellaceae科下一個(gè)未鑒定屬、未鑒定屬、平臍疣孢屬(Zasmidium)、Capnodiales目下一個(gè)未鑒定屬、散囊菌目(Eurotiomycetes)下一個(gè)未鑒定屬、銀耳目(Tremellales)下一個(gè)未鑒定屬、考克娃酵母屬(Kockovaella)，其豐度分別為42.18%、16.31%、13.25%、9.82%、7.97%、1.31%、1.15%、1.13%，測得序列條數(shù)少于500條的其他種屬合計(jì)共占6.88%。油樟的寄生植物桑寄生測得序列數(shù)量超過500條的屬有未鑒定的子囊真菌屬、未鑒定屬、Capnodiales目下一個(gè)未鑒定屬、Derxomyces、Zasmidium、Mycosphaerellaceae科下一個(gè)未鑒定屬、新擬盤鄉(xiāng)毛孢屬(Neopestalotiopsis)、假小尾孢屬(Pseudocercosporella)、Phialophora，其豐度分別為50.43%、11.09%、9.92%、4.30%、4.27%、3.98%、2.52%、1.64%、1.39%，測得序列條數(shù)少于500條的其他種屬合計(jì)共占10.46%。

從圖4可以看出，桂花、油樟和桑寄生的共有屬達(dá)188個(gè)，獨(dú)有屬分別僅有53、31、88個(gè)，且油樟及其寄生植物內(nèi)生真菌共有屬的數(shù)量不超過桂花與桑寄生內(nèi)生真菌共有屬的數(shù)量，表明在相同環(huán)境背景下，不同植物的內(nèi)生真菌種屬非常相似，完全相同的環(huán)境及營養(yǎng)條件并不能增加共有屬的數(shù)量，造成不同植物內(nèi)生真菌種屬差異的主要原因仍是植物遺傳特性。

從圖5可以看出，同一環(huán)境中的桂花、油樟及其寄生植物的內(nèi)生真菌主要優(yōu)勢種屬均包括未鑒定的子囊真菌、未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個(gè)未鑒定屬、Capnodiales目下一個(gè)未鑒定屬，表明這4個(gè)屬的真菌主要來自其生長環(huán)境。

從聚類分析來看，與桂花相比，油樟和桑寄生的內(nèi)生真菌區(qū)系構(gòu)成更接近，體現(xiàn)在油樟及桑寄生內(nèi)生真菌的主要優(yōu)勢屬，包括未鑒定的子囊真菌屬、Tremellales目下一個(gè)未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個(gè)未鑒定屬、Capnodiales目下一個(gè)未鑒定屬及毛孢子菌屬(Trichosporon)，其次，裂褶菌屬(Schizophyllum)、長蠕孢屬(Helminthosporium)、Kockovaella及1個(gè)未鑒定屬的豐度均較為相近，但兩者仍有22個(gè)屬的內(nèi)生真菌豐度差異較大，如青霉素(Penicillium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)只在油樟中分布，這些屬可能與樟油的形成有關(guān)[7]，布勒擲孢酵母屬(Bullera)、綠霉菌屬(Metarhizium)、被孢霉屬(Mortierella)只在桑寄生中分布，由于油樟及其寄生植物桑寄生除植物遺傳特性不同外，生長環(huán)境及營養(yǎng)條件完全一樣，因此，兩者對上述種屬內(nèi)生真菌的選擇性可能主要源于植物遺傳特性。

3 討論

從研究方法來看，本課題組曾采用培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)油樟優(yōu)勢真菌為組絲核菌屬(PhacodiumPers.)和痂圓孢屬(Sphacelomade Bary)[8]，與本研究采用高通量測序發(fā)現(xiàn)的油樟優(yōu)勢內(nèi)生真菌明顯不同，且由于避免了培養(yǎng)條件的選擇性，使用該方法揭示的內(nèi)生菌數(shù)量、種屬都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法[16-17]，表明在內(nèi)生菌的多樣性研究方面，高通量測序法能更加真實(shí)地反映植物內(nèi)生菌的實(shí)際區(qū)系構(gòu)成，但植物內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用仍需要結(jié)合傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法，以獲得純培養(yǎng)菌株或某種富集條件下的菌群。

從植物內(nèi)生菌與環(huán)境的關(guān)系來看，同一環(huán)境的不同植物擁有高度相似的內(nèi)生細(xì)菌及內(nèi)生真菌種屬，不同來源植物內(nèi)生真菌區(qū)系構(gòu)成差異較大，以桂花為例，盧東升等采用平板培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢分離得到桂花葉片4種優(yōu)勢種屬大莖點(diǎn)霉屬(Macrophoma)、鏈格孢屬(Alternaria)、刺盤孢霉屬(Colletotrichum)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)[18]，而本研究中桂花優(yōu)勢種屬則為未鑒定的子囊真菌、Tremellales目下一個(gè)未鑒定屬、Teratosphaeriaceae科下一個(gè)未鑒定屬、Capnodiales目下一個(gè)未鑒定屬、Fusarium、Derxomyces，除研究方法的差異外，桂花來源的不同可能是造成其內(nèi)生菌區(qū)系差異的主要原因，植物內(nèi)生菌的區(qū)系構(gòu)成與其生長環(huán)境具有非常密切的關(guān)系，脫離植物生長環(huán)境來研究某種植物的內(nèi)生菌區(qū)系構(gòu)成是不科學(xué)的，恰當(dāng)?shù)淖龇ㄊ菍?nèi)生菌作為一個(gè)群體，研究其與宿主、環(huán)境的生態(tài)關(guān)系。在本研究中，3種具有迥異化學(xué)成分的植物，其內(nèi)生菌區(qū)系構(gòu)成卻高度相似，可能是由于生長在相同環(huán)境的植物容易獲得相似的內(nèi)生菌，但這些內(nèi)生菌中絕大多數(shù)與植物之間的聯(lián)系較松散，無論是植物內(nèi)部，還是外部的相鄰環(huán)境，都僅僅是作為其適宜的居留地，僅有少數(shù)內(nèi)生菌特別是內(nèi)生真菌與植物之間存在不同程度的共代謝關(guān)系[19-20]。如誘導(dǎo)、激活植物形成某些活性代謝產(chǎn)物，同時(shí)這些代謝產(chǎn)物又反過來對內(nèi)生菌的分布產(chǎn)生影響[21]，這在一定程度上解釋了道地藥材的部分成因[22]。本研究通過比較油樟、油樟寄生植物、油樟相鄰喬木桂花內(nèi)生菌區(qū)系差異，也從另一角度證實(shí)了生態(tài)環(huán)境對植物內(nèi)生菌分布的重要影響，為植物生長的微生物生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供了依據(jù)，也為植物內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用提供了重要參考。