魏超，代曉航，郭靈安

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（成都），四川成都 610066）

我國是生產(chǎn)和食用芽苗菜最早的國家，通常情況下，植物在芽苗期的營養(yǎng)成分優(yōu)于種子和成熟期[1]。芽苗菜被認(rèn)為是一種自然健康的食品，但由于芽苗菜是生食的，所以自1973年以來，在美國和其他一些國家多次爆發(fā)了因?yàn)槭秤醚棵绮硕l(fā)的食源性疾病[2]。蔬菜產(chǎn)品中長期存活和生長著各種微生物，競爭或互利微生物的群落狀況與蔬菜產(chǎn)品的環(huán)境條件及加工處理方法有關(guān)，學(xué)者建議使用競爭微生物來提高最小化加工食品的安全性[3]。有研究表明芽菜中典型的需氧菌總數(shù)在107～109范圍[4]，在商業(yè)操作下有污染的種子在萌芽和生長過程中病原菌會(huì)增加幾個(gè)對數(shù)單位[5]，芽苗菜食用安全風(fēng)險(xiǎn)隱患較高，對其表面微生物的調(diào)查、控制成為研究的熱點(diǎn)[6～8]。預(yù)測微生物學(xué)是數(shù)量化描述微生物的學(xué)科，它對食品的保鮮期做出合理預(yù)測，從而成為監(jiān)測儲(chǔ)藏、流通和零售過程安全性評估的有效手段[9～12]。宏基因組(Metagenome)(也稱微生物環(huán)境基因組 Microbial Environmental Genome，或元基因組)，是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段，可以了解微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等的微生物研究方法[13,14]。

本研究采用多種物理化學(xué)等清洗手段對芽苗菜表面微生物進(jìn)行清除，采用宏基因組學(xué)的方法研究清洗前后微生物的種群變化，建立清洗后芽苗菜的微生物生長模型，對特征微生物進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，本文旨在對不同方法處理下的芽苗菜微觀微生物生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，并評價(jià)不同清除方法對芽苗菜微生物風(fēng)險(xiǎn)控制能力，旨在為芽苗菜生產(chǎn)和食用安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供理論保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：麻子豆苗，成都某生產(chǎn)基地購得。

試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)自（MYP），北京陸橋生物科技有限公司；α-氰-4-羥基肉桂酸（2-cyano-3-(3-hydroxyphenyl)-CHCA），美國SIGMA公司；乙腈、乙醇，美國Fisher Scientific公司；甲酸，美國 TEDIA公司；含氯消毒劑（主要成分為二氯異氰尿酸鈉），四川久榮化工；果蔬清洗劑（主要成分：陰離子表面活性劑，兩性離子表面活性劑，某天然殺菌成分），法國優(yōu)龍納特公司；小量DNA提取試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit，美國 OMEGA 公司，Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒，美國Life公司，2×Taq Master Mix，美國 Vazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GXZ智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS），日本島津公司；HF-safe-1200生物安全柜，上海立申儀器設(shè)備有限公司；YM75Z高壓滅菌鍋，上海三申儀器設(shè)備有限公司；菌落計(jì)數(shù)器，杭州迅數(shù)數(shù)碼科技公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國 UVP；100TM Thermal Cyeler PCR 儀，BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物總DNA的提取與測序分析

總 DNA 提?。喝?15 g芽苗菜樣品加入 25 mL 1xPBS溶液中強(qiáng)烈震蕩，使樣品表面菌體能夠被洗到液體中，取適量震蕩液體分多次加入無菌離心管12000 r/min離心2 min，棄上清，留取沉淀進(jìn)行提取。DNA提取方法具體提取步驟參照 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書[15]。

16S rDNA 擴(kuò)增：V3-V4引物：341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'， 805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'；擴(kuò)增程序：第一次擴(kuò)增預(yù)變性 94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s、45 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，進(jìn)行 20 個(gè)循環(huán)；延伸 72 ℃ 7 min。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，預(yù)變性95 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min。PCR 結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果見圖1。測序由上海生工完成。

數(shù)據(jù)分析：通過 barcode區(qū)分樣品序列，去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，根據(jù)序列之間的距離采用UPORSE軟件進(jìn)行聚類，構(gòu)建操作分類單元（OTU），在RDP classifier和NCBI blast+軟件相應(yīng)數(shù)據(jù)庫下對OUT進(jìn)行比對，并進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算物種豐度。

1.3.2 芽苗菜微生物消除方法

處理方法分別為：①水洗，自來水沖洗 5 min；②輻照，輻照劑量3.5 kgy；③冷熱激，80 ℃無菌水浸泡5 s，4 ℃冰水浸泡30 min，反復(fù)一次；④含氯消毒劑，配置濃度?=1.0%水溶液，樣品浸泡1 min，自來水沖洗1 min；⑤果蔬清洗劑，配置濃度?=1.0%水溶液，樣品浸泡1 min，自來水沖洗1 min。未經(jīng)任何處理芽苗菜為空白對照。

1.3.3 微生物預(yù)測模型的建立

1.3.2中清洗后芽苗菜無菌分裝于無菌均質(zhì)袋中，放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h，分別在培養(yǎng)的不同時(shí)間設(shè)點(diǎn)取單獨(dú)包裝樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)檢測，檢測方法為GB 4789.2[16]，細(xì)菌總數(shù)和時(shí)間計(jì)數(shù)結(jié)果導(dǎo)入Combase軟件進(jìn)行擬合，擬合方法為Baranyi and Roberts模型，見公式1、2。獲得芽苗菜表面微生物生長一級模型。

式中：t為時(shí)間，h；Y(t)為t時(shí)的菌數(shù)，CFU/g；Y0為初始菌數(shù)，CFU/g；Ymax為最大菌數(shù) CFU/g；μmax為最大比生長速率；h0為模型的參數(shù)。

1.3.4 微生物的選擇性培養(yǎng)及鑒定

將芽苗樣于生理鹽水中進(jìn)行1:10稀釋，稀釋液繼續(xù)進(jìn)行1:10，1:100倍稀釋，取0.25 mL稀釋液后涂布于營養(yǎng)瓊脂、MYP培養(yǎng)基，單菌落純化后質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定。

前處理方法：接種環(huán)取菌適量加入1.0 mL ?=70%乙醇水溶液中，震蕩30 s，離心1 min棄上清液，加入?=75%乙酸水溶液70 μL震蕩20 s，常溫超聲10 min，加入70 μL乙腈震蕩均勻，離心1 min取上清液1 μL 點(diǎn)至靶板，加入1 μL CHCA，晾干。

質(zhì)譜條件：固定聚焦337 nm，檢測器線性陽模式，MALDI離子源，激光束能頻 73～78 Hz，收集范圍2000～20000（m/z），校準(zhǔn)品 ATCC 8739 大腸桿菌。

數(shù)據(jù)分析：分離微生物獲得的質(zhì)譜峰圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入MALDI-TOF/SARAMIS微生物鑒定系統(tǒng)與其中的超級譜圖中特征性標(biāo)識(shí)峰的質(zhì)核比（m/z）進(jìn)行多重比較，特征峰（相對相差＜0.08%）加權(quán)后計(jì)算相關(guān)系數(shù)以獲得相應(yīng)微生物的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽苗菜處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果及清洗后微生物生長狀況分析

芽苗菜中微生物總體數(shù)量約為 1.27×106CFU/g，換成對數(shù)單位為6.104 lgCFU/g，對數(shù)單位可以表現(xiàn)微生物污染的數(shù)量級，是比較通用的微生物計(jì)數(shù)單位。不同清洗方法對芽苗菜的微生物的去除量見表 1，處理后芽苗菜樣品微生物生長點(diǎn)線圖見圖 1，不同方法擬合后微生物增值模式圖見圖2。

圖1 Combase擬合輻照處理后微生物生長模型（I級）Fig.1 Microbial growth model after radiation treatment by Combase (Class I)

圖2 不同處理方法微生物生長預(yù)測模型Fig.2 Microbial growth prediction models for different treatments

由圖2可以看出輻照對微生物的祛除量最高，此數(shù)值是在輻照劑量3.5 kgy下獲得，低輻照劑量對微生物去除量極低，較高的輻照劑量又可使芽苗菜殺青變熟[17]，3.5 kgy為本實(shí)驗(yàn)處理中殺青的臨界劑量，輻照過后樣品中微生物生長的延滯期為27.333±10.558 h，最大生長速率為0.0485±0.0109，在90 h左右后進(jìn)入穩(wěn)定期，最大濃度值為5.202±0.215 lgCFU/g；含氯消毒劑的在5種處理中微生物祛除效果第二名，其生長模型中，微生物的數(shù)量得到一定水平的控制，但處理過后樣品保有明顯的氯氣味道，影響其食用品質(zhì)；冷熱激的穩(wěn)定最大濃度為5.853±0.131 lgCFU/g，較其他方法微生物的最大濃度最低，但此種方法處理不好也會(huì)使芽苗菜殺青，影響食用品質(zhì)。

另外水洗和冷熱激處理中微生物最大比生長速率（μmax）較接近，這與兩種處理都未添加外源藥劑僅改變芽苗菜的水分活度有關(guān)。比生長速率為單位小時(shí)單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量，它是表征微生物生長速率的一個(gè)參數(shù)，同種微生物在同種培養(yǎng)基的條件下最大比生長速率基本相同，這與微生物特性有關(guān)[18]，實(shí)驗(yàn)中微生物計(jì)數(shù)為多種群計(jì)數(shù)，雖然培養(yǎng)溫度、水分活度等基本相同，但微生物群落結(jié)構(gòu)略有差異，結(jié)合實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生誤差，最大比生長速率仍有一定差異，但總體差異較小。

本實(shí)驗(yàn)中對芽苗菜微生物預(yù)測模型整體μmax都較低且延滯期波動(dòng)明顯，可能由于微生物在芽苗菜的外表面生長，除水分活度外，沒添加營養(yǎng)培養(yǎng)基，微生物營養(yǎng)來自于植物組織破壞后的汁液外溢為貧瘠營養(yǎng)條件，所以微生物預(yù)測模型中微生物的總體μmax都較低，但除了含氯消毒劑對微生物的整體生長有后續(xù)影響外，其余方法都在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)到清洗前的初始數(shù)量級。

表1 不同清洗方法對芽苗菜微生物的祛除量及最大比生長速率Table 1 Different cleaning methods of sprouts microbes eliminate the amount and the maximum specific growth rate

2.2 芽苗菜微生物污染及清洗后污染調(diào)查

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 Procedure for PCR-Amplification

圖4 不同處理的微生物屬級豐度及聚類圖Fig.4 Genus abundance and cluster dendrogram on different treatment

采用宏基因組區(qū)域 V3-V4區(qū)測序的方法獲得芽苗菜表面的微生物種群豐度，微生物總DNA提取圖見圖 3，芽苗菜處理過后對其進(jìn)行宏基因組的調(diào)查結(jié)果及相應(yīng)物種豐度進(jìn)行聚類分析圖見圖4，由圖4可以看出水洗處理對微生物的群落狀況影響較小，其次是冷熱激處理，兩種處理與芽苗菜原樣中可辨優(yōu)勢群落為假單胞菌屬和乳桿菌屬；果蔬清洗劑處理過后不可辨微生物種類與假單胞菌屬微生物占比增多，可能與果蔬清洗劑中外源藥劑有關(guān)；芽苗菜整體群落結(jié)構(gòu)與原樣差異最大的為輻照處理，輻照處理后優(yōu)勢可辨菌群為芽孢菌屬，芽孢菌屬細(xì)菌有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可耐一定劑量的輻照[19]，當(dāng)輻照對其他微生物進(jìn)行祛除后，具有特殊抵抗能力的芽孢菌屬為優(yōu)勢菌群，在合適的培養(yǎng)條件下繼續(xù)增殖。

宏基因組測序結(jié)果中仍有一部分微生物為不可識(shí)別，可能與樣品處理方法有關(guān)。綜合考慮芽苗菜微生物整體的群落變化和微生物生長模型中的最大比生長速率的值可以看出，雖然調(diào)查微生物生長模型為混合種群數(shù)據(jù)，但種群結(jié)構(gòu)的變化仍舊反應(yīng)在最大比生長速率的差異，即微生物種群結(jié)構(gòu)相似，最大比速率值接近。

2.3 優(yōu)勢種群微生物的鑒定

采用選擇性培養(yǎng)方法對芽苗菜樣品中優(yōu)勢菌群微生物進(jìn)行分離和質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜圖見圖5，芽孢菌屬的微生物鑒定為蠟樣芽孢菌；克雷伯菌屬的細(xì)菌為產(chǎn)酸克雷伯菌和肺炎克雷伯菌；假單胞菌屬的細(xì)菌為銅綠假單胞菌；乳桿菌屬為產(chǎn)酸乳桿菌；沙雷菌屬為褪色沙雷菌。由于樣品種群結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，同一屬中可能包括多個(gè)種，鑒定中沒有分開，但已有鑒定結(jié)果也可印證宏基因組實(shí)驗(yàn)對微生物種類豐度分析的準(zhǔn)確性。

圖5 微生物鑒定質(zhì)譜圖Fig.5 Microorganism masspectrum of MALDI-TOF MS

3 討論

3.1 不同處理方法對芽苗菜微生物消除效果評價(jià)

實(shí)驗(yàn)針對微生物的污染采用的指標(biāo)為細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)，細(xì)菌總數(shù)雖然不能代表食源性致病微生物可量化的安全風(fēng)險(xiǎn)，但可以反映樣品受微生物污染的總體情況，為衛(wèi)生指標(biāo)。從不同處理方法對微生物細(xì)菌總數(shù)的降低水平上來看，輻照方法對微生物的消殺能力最強(qiáng)，然后依次為含氯清洗劑、果蔬清洗劑、冷熱激和水洗，但沒有一種方法可以完全祛除芽苗菜表面的全部微生物，這與蔬菜表面的凸凹結(jié)構(gòu)和微生物特性有關(guān)，果蔬表面有一些微觀疏水區(qū)[20]，在清洗過程中一部分微生物附著在此區(qū)間內(nèi)，此外蔬菜損傷部位、氣孔、毛孔等會(huì)使微生物內(nèi)化，清洗過程無法完全將其除去[21,22]。

試驗(yàn)中芽苗菜處理后未清除的細(xì)菌會(huì)在水分活度升高和損傷汁液外溢的條件下繼續(xù)增殖恢復(fù)清洗前的數(shù)量級。有研究表明，在果蔬表面微生物的相互作用非常復(fù)雜，細(xì)菌存活、生長與對蔬菜的處理方法有關(guān)[23,24]。本試驗(yàn)的處理改變了芽苗菜原有微生物的菌群格局，在繼續(xù)增值的過程中，生長較快且抗逆性較強(qiáng)的微生物成為優(yōu)勢種群。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出與水分活度有關(guān)的消除方法對微生物總體種類影響較小，含氯清洗劑和果蔬清洗劑因其殘留對微生物的種類的豐度有所影響，但影響較輻照處理相差較多。輻照方法雖然對微生物的消殺效果最顯著，但此種方法對芽孢菌屬無效果，在改變菌群結(jié)構(gòu)后，芽孢菌群占領(lǐng)主要生態(tài)位。經(jīng)質(zhì)譜法鑒定分離芽孢菌屬細(xì)菌，為食源致病菌蠟樣芽孢桿菌，反而提高了其食用安全風(fēng)險(xiǎn)。且最早報(bào)道芽苗菜引起的衛(wèi)生事件是由產(chǎn)腸毒素的蠟樣芽孢桿菌引起[25]。可見對芽苗菜微生物的控制最有效的方法未必是最合適的方法。

3.2 芽苗菜蔬菜微生物食用安全評價(jià)

即食生鮮蔬菜食用過程未經(jīng)過熱加工處理，一方面保留了蔬菜的原有口感和營養(yǎng)成分，另一方面也為病源微生物進(jìn)入體內(nèi)開辟了綠色通道。根據(jù)美國FDA、CDC、FSIS的報(bào)告顯示，2016～2017年美國的食源性疾病暴發(fā)以及食品污染導(dǎo)致的食品召回事件，其主要原因均由食源性致病菌而引起，F(xiàn)AD向消費(fèi)者發(fā)布了許多有關(guān)食用生芽菜類食品的風(fēng)險(xiǎn)[26]，另外FDA在食品法規(guī)中，生芽菜食品被認(rèn)為是一種“潛在危險(xiǎn)食品”[27]。本實(shí)驗(yàn)中成都產(chǎn)芽苗菜中確實(shí)存在多種微生物的附著，但條件致病菌等為優(yōu)勢菌群，處理過程可以降低食用風(fēng)險(xiǎn)，但處理后隨保藏時(shí)間延長，依然會(huì)提高其食用風(fēng)險(xiǎn)，建議消費(fèi)這個(gè)在消費(fèi)芽苗菜的過程中盡量在處理后合理時(shí)間段食用。此外不合理的微生物的消除方法反而才會(huì)升高其食用風(fēng)險(xiǎn)，建議產(chǎn)業(yè)質(zhì)量控制部門對產(chǎn)品后續(xù)處理進(jìn)行研究和規(guī)范，盡量規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)。