唐秋琳，畢 鋒

(四川大學(xué) 華西醫(yī)院腫瘤分子靶向治療研究室，四川 成都 610041)

惡性腫瘤至今仍是世界醫(yī)學(xué)界一大難題，每年全世界有數(shù)以千萬計(jì)的人罹患惡性腫瘤，并且呈逐年增長態(tài)勢。人類對惡性腫瘤的抗?fàn)幉粌H體現(xiàn)在醫(yī)療手段的不斷改進(jìn)，更希望從分子細(xì)胞水平探究腫瘤發(fā)生的機(jī)制[1-3]。惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性包括形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞增殖抑制消除，細(xì)胞的浸潤性、永生性、異質(zhì)性及遺傳改變等。現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)應(yīng)用目前的技術(shù)手段，針對腫瘤的生物學(xué)特性，在實(shí)驗(yàn)室體外研究中，對腫瘤的惡性生物學(xué)表型，都建立了相應(yīng)的檢測方法。其中，浸潤性是指腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性行為，包括遷移能力和侵襲能力，我們在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞仍保持有這種性狀[4]。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤入其他組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。因此，可以使用人工隔膜(Transwell)對腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力進(jìn)行檢測。Transwell?即底部具有聚碳酸酯膜的活置式培養(yǎng)小室，膜可以將細(xì)胞在孔板內(nèi)的培養(yǎng)空間分隔，分上下層培養(yǎng)液以膜相隔，實(shí)驗(yàn)利用聚碳酸酯膜的通透性，小室內(nèi)外的培養(yǎng)成分可以相互滲透，相互影響，應(yīng)用不同孔徑的聚碳酸酯膜可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等研究[5-6]，不同的廠家有不同的商品名，其原型為Boyden chamber[7]，目前已逐漸為Transwell所取代，如圖1所示。

作為一種商品化實(shí)驗(yàn)材料，Transwell有生產(chǎn)商的使用說明，但在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)節(jié)問題還需從實(shí)踐中總結(jié)獲得，目前缺乏文章系統(tǒng)地對Transwell小室在侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)上進(jìn)行詳細(xì)地分析，本文根據(jù)自身實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，主要對使用Transwell對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲和遷移檢測過程中容易遇到并忽略的細(xì)節(jié)進(jìn)行解析，并總結(jié)相應(yīng)的解決方案，以輔助廣大科研工作者順利完成該部分的實(shí)驗(yàn)工作。

圖1 Transwell?細(xì)胞侵襲檢測示意圖

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞株，可以用于具有貼壁性能的細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中所使用的為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1299；DMEM高糖及1640培養(yǎng)基(GIBICO)；新生牛血清及胎牛血清(GIBICO)；胰酶、PBS、結(jié)晶紫染液、4%多聚甲醛固定液；Transwell小室及Matrigel基質(zhì)膠(均購自Corning公司)；24孔板(購自Eppendorf公司)棉棒、眼科鑷和倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞侵襲檢測

1)鋪膠，將融解的Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按照一定比例(詳見結(jié)果部分)混合，均勻鋪至Transwell小室底部(上室面)，置于37培養(yǎng)箱進(jìn)行凝固約2～4 h，使其呈凝膠狀；2)接種細(xì)胞,將生長至對數(shù)期的細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，無血清培養(yǎng)基稀釋至一定比例，均勻接種至Transwell小室底部，再將Transwell小室放入加了10%FBS培養(yǎng)基的孔板中培養(yǎng)；3)細(xì)胞染色，培養(yǎng)細(xì)胞24～48 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦拭小室內(nèi)部細(xì)胞及殘余的Matrigel膠，PBS清洗3次，多聚甲醛對小室底部背面穿過的細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫對其進(jìn)行染色，鏡檢計(jì)數(shù)并分析作圖。

1.2.2 細(xì)胞遷移檢測

與侵襲實(shí)驗(yàn)不同的唯一區(qū)別在于不使用Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟相同。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中鋪膠過程中的影響因素

Matrigel matrix基質(zhì)膠來源于EHS小鼠肉瘤，其主要成分為層粘連蛋白、Ⅵ型膠原蛋白、巢蛋白、接觸蛋白和肝素硫酸多糖等模擬細(xì)胞外基質(zhì)的成分，并通過鋪在Transwell小室底部形成與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)相似的膜結(jié)構(gòu)，上室接種細(xì)胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過這種鋪有Matrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況同樣較為相似，用于模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成和物化功能性質(zhì)。

2.1.1 Matrigel基質(zhì)膠的預(yù)冷

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中常有下室穿透細(xì)胞聚團(tuán)嚴(yán)重現(xiàn)象，原因之一是因?yàn)榛|(zhì)膠的鋪膠操作不當(dāng)導(dǎo)致膠面不平，比較常用的Corning公司的Matrigel matrix基質(zhì)膠凝膠凝固點(diǎn)在14℃附近，因此在操作時(shí)應(yīng)特別注意以下3個(gè)方面問題。1)基質(zhì)膠常規(guī)保存溫度為-20℃，Matrigel matrix收到后應(yīng)進(jìn)行分裝，且只能分裝一次，整個(gè)分裝過程要在冰上進(jìn)行，且以后每次實(shí)驗(yàn)時(shí)拿出本次用量的已經(jīng)分裝好的基質(zhì)膠，該次實(shí)驗(yàn)用不完的基質(zhì)膠要扔掉，不可以留作下次使用；使用時(shí)提前一晚置于4℃冰箱使其逐漸融解，融解過程中不得用手觸碰或溫浴管壁。2)鋪膠時(shí)所有相關(guān)材料，如移液槍，槍頭最好能在-20℃或4℃冰箱提前預(yù)冷，整個(gè)操作過程盡量在冰上進(jìn)行。3)鋪膠時(shí)輕柔勻速，盡量保證膠面平齊且將小室底部全部鋪滿以免造成假陽性結(jié)果，膠面不可用槍頭攪動(dòng)，避免膠面不平或氣泡產(chǎn)生。

2.1.2 Martrigel基質(zhì)膠的稀釋比例

幾乎所有的在線實(shí)驗(yàn)方案中，均提到Matrigel膠的稀釋比例應(yīng)該為1∶1～1∶8之間(主要指 Corning Matrigel basement membrane matrix?)，但就Matrigel中所含蛋白的工作濃度而言，這樣的說法不太嚴(yán)謹(jǐn)，對此本文專門咨詢了Corning廠商及技術(shù)支持，推薦Matrigel matrix用于細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的基質(zhì)膠蛋白濃度一般在200～300 μg/mL，而商品中蛋白濃度一般在8～12 mg/mL(具體批次濃度不同，需聯(lián)系生產(chǎn)商)，需要稀釋到很低的倍數(shù)，有的實(shí)驗(yàn)需要低至30倍的稀釋，凝膠凝固后只有很薄的一層，肉眼幾乎無法分辨，且會(huì)析出水相，在使用前需小心吸出水相。但是也有國外文獻(xiàn)稱侵襲實(shí)驗(yàn)所使用Matrigel基質(zhì)膠蛋白濃度為5～6 mg/mL[6]。本文針對在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1299和A549的試驗(yàn)中，所使用Matrigel膠濃度約為2 mg/mL，在接種細(xì)胞4×104/孔(24孔板)的條件下，可獲得較適宜的穿膜細(xì)胞量，因此建議，具體最適濃度需進(jìn)行梯度濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件，如細(xì)胞的侵襲能力、細(xì)胞生長狀態(tài)、接種細(xì)胞數(shù)量多少等條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較為適量的穿膜細(xì)胞。

2.2 腫瘤細(xì)胞侵襲遷移試驗(yàn)中細(xì)胞接種過程中的影響因素

2.2.1 接種細(xì)胞

1)侵襲/遷移能力弱的細(xì)胞在鋪板前可以撤去血清饑餓12～24 h。2)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)一定要盡量嚴(yán)格，以保證各孔細(xì)胞密度均勻，為了避免各孔間由于細(xì)胞計(jì)數(shù)引入的誤差，一般需要重復(fù)三個(gè)副孔。3)種細(xì)胞時(shí)盡量從孔的中間位置滴加，力度柔和，速度盡量慢，以免沖擊力太大破壞膠面；同時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。

2.2.2 注意Transwell小室底部氣泡的產(chǎn)生

Transwell小室在放入孔板時(shí)，常常會(huì)因?yàn)橐后w表面張力的原因在小室底部形成氣泡，氣泡導(dǎo)致的底部液面不均會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞侵襲和遷移能力，因此在放置小室時(shí)，應(yīng)輕柔勻速，若發(fā)現(xiàn)底部產(chǎn)生氣泡，不要拍打板子(這樣做會(huì)使剛鋪好的細(xì)胞重新聚團(tuán))，而應(yīng)將小室輕輕提起，重新放置直至無氣泡。

2.3 腫瘤細(xì)胞侵襲遷移試驗(yàn)中細(xì)胞染色過程中的影響因素

2.3.1 棉簽擦拭Transwell小室內(nèi)部的方法

過大或過小的棉簽都不利于擦拭小室底部，尤其是棉花較為松散的醫(yī)用棉簽，掉落的纖維會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可讀性，應(yīng)該選用大小適中較為緊實(shí)的棉簽，使用前稍微沾濕，沿一個(gè)方向(如順時(shí)針)從邊緣向中心捻動(dòng)棉簽進(jìn)行擦拭，擦拭完立即換一根新的棉簽重復(fù)上述步驟，不應(yīng)一根棉簽反復(fù)擦拭。直至鏡下觀測到確已將凝膠及未遷移的細(xì)胞團(tuán)擦拭干凈。

2.3.2 結(jié)晶紫染色及漂洗時(shí)間

在結(jié)晶紫染色前，應(yīng)將小室內(nèi)外PBS稍吸干，令小室底面細(xì)胞稍干(水分風(fēng)干即止)，再進(jìn)行染色，效果較好。染色及PBS漂洗時(shí)間應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況多加摸索，確定最佳的染色及脫色時(shí)間。理想的染色結(jié)果是細(xì)胞均勻著色，形態(tài)整齊，Transwell小室膜背景干凈，能清楚地看到微孔，如圖2所示；染色后將小室稍風(fēng)干，置于滴加了甘油封片劑的載玻片上，倒置顯微鏡下觀測；也可將底部膜用手術(shù)刀片仔細(xì)分離，置于正置顯微鏡下觀測，效果更好(但使用此方法后，Transwell小室將不能回收再利用)。

圖2 穿膜細(xì)胞的形態(tài)(×100)

2.4 Transwell小室回收利用的處理方法及對結(jié)果的影響

從上文可知,Transwell 小室底部為具有一定孔徑的聚碳酸酯膜等支撐材料，因此，在不影響細(xì)胞生長及染色的前提下，小室在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，可以重復(fù)利用3～5次，具體處理方法為：1)棉簽初步清除小室底部已著色細(xì)胞后，小室置于1%胰酶中搖動(dòng)浸泡過夜；2)棉簽再次擦拭，流動(dòng)水輕柔沖洗后，浸泡于75%乙醇中備用；3)使用前，流動(dòng)水清洗，晾干，紫外線消毒，正反面各照2 h以上。注意：1)不能使用微波爐消毒或超聲清洗，會(huì)破壞孔徑，導(dǎo)致穿膜細(xì)胞數(shù)誤差；2)棉簽擦拭力度要適中，力量過大導(dǎo)致的孔膜破損或變形，該小室即不能再次利用。

2.5 問題分析

2.5.1 穿膜細(xì)胞過多可能的原因

1)細(xì)胞鋪板數(shù)量過多，應(yīng)做梯度接種預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的細(xì)胞接種數(shù)。2)細(xì)胞過多導(dǎo)致無法計(jì)數(shù)時(shí)的解決方案：如穿膜細(xì)胞過多無法計(jì)數(shù)，在染色后可用33%醋酸脫色，洗脫結(jié)晶紫在酶標(biāo)儀上590 nm 處測定其OD值，可間接反映細(xì)胞數(shù)，避免樣本浪費(fèi)，但如若需要遷移/侵襲圖片，仍需重復(fù)試驗(yàn)。

2.5.2 穿膜細(xì)胞太少可能的原因

1)需考慮細(xì)胞的侵襲能力?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族[8]，幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。如果多次重復(fù)試驗(yàn)均未見細(xì)胞侵襲結(jié)果，可以檢測一下該細(xì)胞株基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的表達(dá)情況。2)細(xì)胞接種數(shù)量過少，應(yīng)做梯度接種預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的細(xì)胞接種數(shù)。3)穿膜細(xì)胞由于粘附貼壁能力不強(qiáng)，落到下室孔板培養(yǎng)液中，可以在膜下表面涂纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)增加細(xì)胞貼壁性能及趨化能力。4)小室放入孔板中時(shí)，下部帶有氣泡，導(dǎo)致趨化作用消失，細(xì)胞無法穿膜。5)Transwell小室孔徑的選擇需要重新確認(rèn)。Transwell小室底部的通透性支持物(膜)存在不同材料制成及不同孔徑大小，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體要求選擇不同的系統(tǒng)，具體選擇標(biāo)準(zhǔn)可在線查詢(Transwell通透性支持物的使用和選擇手冊，www.Corning.com/lifescience)。

2.5.3 穿膜細(xì)胞不均勻可能的原因

1)基質(zhì)膠在操作過程中由于器材或環(huán)境溫度過高導(dǎo)致的提前凝聚，會(huì)使膠面不平整，細(xì)胞聚團(tuán)(鋪膠過程詳見2.1.1節(jié))。2)接種過程中，細(xì)胞懸液應(yīng)勻速輕柔滴加至孔中央，并避免因孔板震動(dòng)導(dǎo)致的細(xì)胞聚團(tuán)(24孔板)，或進(jìn)行“十字”搖動(dòng)使細(xì)胞均勻(6孔板)。

3 結(jié)束語

腫瘤細(xì)胞的侵襲是一個(gè)體內(nèi)復(fù)雜的過程，腫瘤細(xì)胞株的侵襲性被認(rèn)為與其轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，之前對腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的研究主要通過二維模式(細(xì)胞平面培養(yǎng))進(jìn)行，而事實(shí)上，體內(nèi)的侵襲遷移過程是發(fā)生在三維(3D)的自然環(huán)境中，環(huán)境因素包括腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分(細(xì)胞外基質(zhì))以及腫瘤微環(huán)境。因此，目前關(guān)于侵襲技術(shù)的前沿研究主要體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)三維狀態(tài)下，檢測細(xì)胞的侵襲遷移機(jī)制，如在一個(gè)三維微環(huán)境下檢測乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力并確定入侵的癌細(xì)胞數(shù)量，以及在此過程中藥物對遷移和侵襲能力的影響[9]?；蚶弥亓?，將細(xì)胞懸液制成球體，嵌入到三維基底膜材料混合物中，對球體進(jìn)行藥物/抑制劑作用或改變細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，從而完成癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)[10]。

腫瘤細(xì)胞的遷移也在一定程度上體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并且在生理發(fā)育過程中具有重要意義。在胚胎發(fā)育期間單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞集群可以移動(dòng)相對較長的距離，細(xì)胞遷移在傷口愈合和許多成年動(dòng)物的免疫過程中也起到關(guān)鍵作用。另一方面，不受控制的惡性細(xì)胞的遷移也會(huì)導(dǎo)致癌癥的入侵。

在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力檢測上，Transwell小室檢測法因?yàn)楹啽阋仔?，重?fù)性高，目前是公認(rèn)度比較高的方法，因此應(yīng)認(rèn)識到，Transwell不等同于侵襲或遷移檢測，而僅是方法之一。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雖然Matrigel matrix基質(zhì)膠已經(jīng)很好地模擬了真實(shí)情況下胞外基質(zhì)的構(gòu)成，且廣泛用于侵襲、體外血管生成或體外成瘤實(shí)驗(yàn)，但是與自然胞外基質(zhì)相比，Matrigel膠仍缺乏主要粘連蛋白鏈中的粘連蛋白a1，以及無法達(dá)到自然產(chǎn)生的不溶性基底膜結(jié)構(gòu)的完整性[6,13]，在使用過程中應(yīng)當(dāng)注意。綜上所述，雖然Transwell目前作為一種通用的檢測細(xì)胞侵襲遷移能力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)被廣泛用于腫瘤研究中，但其仍有許多局限性，不斷探索開發(fā)新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，方能滿足發(fā)展迅速的腫瘤基礎(chǔ)研究需求。