徐 敏，劉 君，阿衣古力·阿布都瓦依提

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

葉綠素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生理指標(biāo)之一，其含量與植物光合速率、營(yíng)養(yǎng)狀況、光合作用等密切相關(guān)，葉綠素含量的測(cè)定無論是在生理上還是在品種選育及植物抗性方面的研究都是必測(cè)指標(biāo)[1-2]。葉綠素含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)是各農(nóng)業(yè)類高等院校大農(nóng)學(xué)相關(guān)專業(yè)必修課程“植物生理學(xué)”實(shí)驗(yàn)中的重要組成部分，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋葉綠素的提取、分離、理化性質(zhì)及定量測(cè)定，在葉綠素的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容教學(xué)過程中，存在的問題較多，葉綠素含量因提取液和提取時(shí)間的不同而存在差異。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，采用超市購買的菠菜和油菜作為實(shí)驗(yàn)材料，須提前以80%丙酮進(jìn)行浸泡8～12 h才可將葉綠素完全提取出來。在這個(gè)過程中存在一些問題，如學(xué)生不能親自動(dòng)手進(jìn)行葉綠素提取操作，丙酮不易購買，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備量大等。在葉綠素提取過程中則存在浸提不徹底、浸提時(shí)間長(zhǎng)且不穩(wěn)定和葉綠素含量定量測(cè)定重復(fù)性差等問題。針對(duì)以上葉綠素實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題，本文就實(shí)驗(yàn)課中常用實(shí)驗(yàn)材料菠菜和油菜從提取方法、提取時(shí)間以及浸泡提取劑3個(gè)方面進(jìn)行了研究，找到了在有限的教學(xué)學(xué)時(shí)操作便捷、重復(fù)性高、提取效果好的方法，為葉綠素的提取、開發(fā)利用和植物生理葉綠素實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了理論支持[3]。

1 材料與提取方法

1.1 材料、試劑與主要儀器

供試材料為油菜和菠菜，均購自超市，保證材料的新鮮度一致。分析純?cè)噭楸?、乙醇、甲醇和二甲基亞砜。主要儀器包括可見分光光度計(jì)(上海棱光S22PC)、單孔八列水浴鍋和萬分之一電子天平(梅德勒)。

1.2 提取方法

1.2.1 浸提法

采用提取液浸提，選取位置一致的葉片，用潮濕的紗布擦凈葉片，避開主葉脈剪成2 mm的細(xì)條，分別稱取細(xì)條0.2 g放入提取液中加塞遮光，稱量材料確保天平小數(shù)點(diǎn)后兩位一致，浸提時(shí)間為8 h、16 h和24 h，搖勻，將提取液分別于波長(zhǎng)645 nm和663 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。提取液共6種，其中，單一成分的提取液是95%乙醇和80%丙酮，混合提取液是丙酮乙醇(1∶1)、丙酮乙醇水(4.5∶4.5∶1)、丙酮甲醇(1∶1)和丙酮甲醇水(4.5∶4.5∶1)。以上溶液分別提取搖勻后，將溶液分別于波長(zhǎng)645 nm和663 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。從葉綠素溶液的吸收光譜可以看出6種吸收光譜基本相似，在波長(zhǎng)433 nm和664～665 nm處都有明顯的吸收峰，在波長(zhǎng)570 nm處有一間斷跳躍，其他不明顯的峰谷所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)也基本相同，如550 nm(谷)、583.4 nm(峰)、604 nm(谷)。故提取液浸提法可以套用Arnon法的計(jì)算公式[4]，計(jì)算葉綠素含量。

葉綠素a含量為：

Chla=(12.71A663-2.59A645)V/1000/W

葉綠素b含量為：

Chlb=(22.88A645-4.67A663)V/1000/W

葉綠素總含量為：

Chla+Chlb=(8.04A663+20.29A645)V/1000/W

式中，A663、A645分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下葉綠素提取液的吸光度，V為提取液體積，W為葉片鮮重，葉綠素含量單位為mg/g。

二甲基亞砜浸提法(DMSO法)是基于Alanetal[5]的方法，用二甲基亞砜(分析純)在60℃恒溫水浴條件下避光浸提實(shí)驗(yàn)材料1 h，收集上清液待測(cè)。二甲基亞砜法測(cè)定吸光度(A)值檢測(cè)波長(zhǎng)為665 nm、649 nm和480 nm，采用以下公式計(jì)算。

葉綠素a含量為：

chla=(12.19A665-3.45A649)V/1000/W

葉綠素b含量為：

chlb=(21.99A649-5.32A665)V/1000/W

總?cè)~綠素含量=Chla+Chlb

式中，A665、A649分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下葉綠素提取液的吸光度，V為提取液體積，W為葉片鮮重，葉綠素含量單位為mg/g。

1.2.2 研磨法

稱量材料選取位置一致的葉片且確保天平小數(shù)點(diǎn)后兩位一致，用潮濕的紗布擦凈葉片，并剪成2 mm的細(xì)條備用，分別稱取0.2 g放入研缽中，分別用95%乙醇和80%丙酮進(jìn)行研磨提取，過濾洗滌定容至5 mL，搖勻，避光待測(cè)。測(cè)定計(jì)算方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，SPSS進(jìn)行方差分析。為方便描述，如表1所示。

表1 編號(hào)和提取液及提取時(shí)間對(duì)應(yīng)關(guān)系

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素提取液及提取時(shí)間比較

不同提取液和提取時(shí)間下菠菜葉綠素含量如表2所示。表2表明，對(duì)于菠菜葉綠素含量的測(cè)定用95%乙醇提取，提取時(shí)間24 h效果最好，和16 h、8 h存在極顯著差異(p<0.01)；80%丙酮進(jìn)行提取，提取時(shí)間24 h效果最好，和16 h、8 h存在極顯著差異(p<0.01)，80%丙酮的整體提取效果較差；丙酮乙醇和水混合提取液，提取16 h和24 h菠菜葉綠素含量無明顯差異，且和提取8 h差異性顯著；丙酮乙醇混合提取液，提取8 h和16 h菠菜葉綠素含量無差異，且和提取24 h差異性顯著，比提取24 h效果更佳；丙酮甲醇混合提取液，提取8 h效果最佳，和提取16 h、24 h呈極顯著差異(p<0.01)；丙酮甲醇水混合提取液的提取效果在提取8 h、16 h、24 h菠菜葉綠素含量差異性不顯著。以上提取液無論是單一提取液還是混合提取液，提取時(shí)間均較長(zhǎng)。二甲基亞砜法提取法和以上最佳提取液和最佳提取時(shí)間具相比性，則可在1 h內(nèi)達(dá)到以上溶液的提取葉綠素的效果。丙酮存在難購買的市場(chǎng)現(xiàn)象，二甲基亞砜易購買。經(jīng)提取時(shí)間、提取量效果、可重復(fù)性和購買難易程度的比較，二甲基亞砜法是菠菜葉綠素定量測(cè)定的最佳浸提實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法。

表2 不同提取液和提取時(shí)間下菠菜葉綠素含量比較

注：大寫字母表示差異極顯著水平(p<0.01)。

不同提取液和提取時(shí)間下油菜葉綠素含量如表3所示。表3表明，對(duì)于油菜葉綠素含量的測(cè)定單一提取液在提取時(shí)間上的效果比較，用95%乙醇提取，提取時(shí)間24 h效果最好，和16 h、8 h存在極顯著差異(p<0.01)；80%丙酮進(jìn)行提取，提取時(shí)間24 h效果最好，和16 h、8 h存在極顯著差異(p<0.01)，80%丙酮的整體提取效果較差。二甲基亞砜浸提法則可在1 h之內(nèi)達(dá)到以上兩種單一提取液24 h 的效果。而對(duì)于混合提取液在提取時(shí)間上的效果比較，丙酮乙醇水混合提取液，整體提取效果較差；丙酮乙醇混合提取液，3個(gè)提取時(shí)間的總體提取效果均很好，進(jìn)一步比較而言，提取8 h和16 h菠菜葉綠素含量無差異，比提取24 h效果更佳；丙酮甲醇混合提取液，提取8 h效果最佳，和提取16 h、24 h呈極顯著差異(p<0.01)，且提取16 h的效果最差；丙酮甲醇水混合提取液，提取8 h菠菜葉綠素含量差異性和16 h、24 h差異性極顯著(p<0.01)，且在提取24 h后油菜葉綠素含量出現(xiàn)顯著下降。綜合以上比較，二甲基亞砜法是油菜葉綠素定量測(cè)定的最佳浸提實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法。

表3 不同提取液和提取時(shí)間下油菜葉綠素含量比較

注：大寫字母表示差異極顯著水平(p<0.01)。

2.2 葉綠素提取方法的比較

本研究中涵蓋浸提法和研磨法。在提取菠菜葉綠素中，用95%乙醇研磨法和95%乙醇提取24 h浸提法兩種方法提取的菠菜葉綠素含量差異性不顯著，而80%丙酮研磨法和80%丙酮提取24 h浸提法兩種方法提取的菠菜葉綠素含量存在極顯著差異(p<0.01)，80%丙酮研磨法顯著優(yōu)于80%丙酮浸提法。

研磨法和提取液浸提法相比，菠菜葉綠素含量存在極顯著差異(p<0.01)，根據(jù)混合提取液的成分和比例的不同，提取效果及可重復(fù)性表現(xiàn)不同，有的優(yōu)于研磨法而有的則相反。

浸提法操作簡(jiǎn)便，但耗時(shí)較長(zhǎng)，研磨法操作繁瑣，操作時(shí)間較短，而二甲基亞砜法融合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)較短且與研磨法的提取效果不存在顯著性差異，且重復(fù)性很好，極適合在菠菜葉綠素定量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣使用。

在提取油菜葉綠素中，用95%乙醇研磨法和95%乙醇提取24 h浸提法兩種方法提取的油菜葉綠素含量差異性不顯著，95%乙醇研磨法顯著優(yōu)于95%乙醇提取8 h、16 h浸提法。而80%丙酮研磨法和80%丙酮提取24 h浸提法兩種方法提取的油菜葉綠素含量存在極顯著差異(p<0.01)，80%丙酮研磨法顯著優(yōu)于80%丙酮浸提法。

研磨法和混合液浸提法相比，油菜葉綠素含量也存在極顯著差異(p<0.01)，根據(jù)混合提取液的成分和比例的不同，提取效果及可重復(fù)性表現(xiàn)不同，有的優(yōu)于研磨法而有的則相反。二甲基亞砜浸提法是油菜葉綠素定量提取測(cè)定的最佳方法。

3 討論與結(jié)論

使用單一提取液提取菠菜葉綠素的最佳提取液是二甲基亞砜，提取時(shí)間1 h，提取效果最差的單一提取液是80%丙酮，提取時(shí)間是8 h。有研究表明二甲基亞砜的提取效率高于80%丙酮[6]。使用混合浸提液提取菠菜葉綠素的最佳混合提取液是丙酮甲醇混合提取液，提取時(shí)間是8 h，其次是丙酮甲醇水混合提取液，浸提時(shí)間是8 h。單獨(dú)用丙酮或乙醇浸提速度不及混合液提取，表明丙酮與甲醇(乙醇)存在協(xié)同萃取效應(yīng)[7]。這與文獻(xiàn)[7]在玉米葉綠素含量測(cè)定方法研究中結(jié)論一致。

綜合而言，同種提取液在提取效果一致的基礎(chǔ)上，提取時(shí)間越短越好。所以用提取法提取油菜葉綠素的最佳提取液為丙酮乙醇混合液、丙酮甲醇混合液或者丙酮甲醇水混合液，提取時(shí)間是8 h效果最佳，三者之間不存在差異性。與文獻(xiàn)[1]在兩種葉綠素提取方法的比較研究中得出的“提取時(shí)間以18 h為佳”結(jié)論不盡一致。由此分析，混合提取液的提取效果顯著好于單一提取液，提取時(shí)間根據(jù)材料而異。

4 結(jié)束語

兩種葉綠素提取方法中，二甲基亞砜浸提法和研磨法用時(shí)較短。研磨法因需研磨、過濾或離心，且操作繁瑣，使用實(shí)驗(yàn)器皿較多，會(huì)造成少量葉綠素浪費(fèi)，實(shí)驗(yàn)者研磨程度會(huì)對(duì)葉綠素含量的測(cè)定產(chǎn)生影響，重復(fù)性較差。二甲基亞砜法用時(shí)短，操作簡(jiǎn)便且重復(fù)性好，二甲基亞砜稍有特殊臭味，經(jīng)毒性試驗(yàn)，有極微弱毒性，毒性低于丙酮。近年來已作為醫(yī)藥用輔助劑及藥載劑，故在一般情況下對(duì)人體無影響[8]。對(duì)DMSO適合葉綠素定量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，葉綠素提取過程只需要1 h，學(xué)生可充分利用時(shí)間進(jìn)行葉綠素的分離和理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)，使用二甲基亞砜法有利于統(tǒng)籌安排寶貴的課堂時(shí)間。該方法已在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)13個(gè)專業(yè)21個(gè)班級(jí)近800名學(xué)生植物生理學(xué)葉綠素實(shí)驗(yàn)教學(xué)中推廣使用。

而在野外葉綠素實(shí)驗(yàn)中，研磨法操作步驟繁瑣，實(shí)現(xiàn)性較差。野外葉綠素實(shí)驗(yàn)浸提法則很便捷，將一定量的材料稱好后剪碎直接放入提取液中，遮光帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。二甲基亞砜法提取時(shí)間較短，雖然二甲基亞砜黏性大，在低于19℃的環(huán)境中極易結(jié)晶，受溫度影響較大[9]。但實(shí)驗(yàn)室常年溫度在25℃左右，不存在結(jié)晶的問題，所以二甲基亞砜法在葉綠素實(shí)驗(yàn)教學(xué)中最為適用，菠菜和油菜葉綠素在60℃的二甲基亞砜中提取速度快，可在規(guī)定的2個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)學(xué)時(shí)中提取徹底并完成測(cè)定，且葉綠素性質(zhì)穩(wěn)定，提取的葉綠素含量重復(fù)性好。二甲基亞砜法因葉綠素穩(wěn)定性好[10]，操作簡(jiǎn)便，易購買攜帶，提取效果穩(wěn)定，同樣適用在溫度不低于19℃野外葉綠素實(shí)驗(yàn)[11-12]中。