汪筱雪 韋繼光 楊振德 羅輯 吳耀軍 楊秀好 羅基同 謝代祖

摘要：【目的】明確廣西西北部核桃真菌性病害種類，并篩選可有效防治核桃炭疽病的藥劑，為核桃病害防治提供科學(xué)依據(jù)。【方法】在廣西西北部的河池市金城江區(qū)、環(huán)江縣、鳳山縣和百色市樂業(yè)縣等核桃種植區(qū)，于核桃病害發(fā)生期開展真菌性病害種類和危害程度調(diào)查，計(jì)算其發(fā)病率及病情指數(shù)。測定43%戊唑醇、45%咪鮮胺、25%嘧菌酯、25%吡唑醚菌酯和40%苯醚甲環(huán)唑等5種殺菌劑對核桃炭疽病菌的室內(nèi)毒力，計(jì)算抑制中濃度（EC50）；選取效果較優(yōu)的3種殺菌劑進(jìn)行核桃炭疽病田間防治試驗(yàn)，測定不同殺菌劑的防治效果?！窘Y(jié)果】調(diào)查區(qū)核桃真菌性病害主要有核桃根腐病、核桃枝枯病、核桃莖點(diǎn)霉黑斑病和核桃炭疽病4種，病原菌分別為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、胡桃楸擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis juglandina）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）真菌和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），其中以核桃炭疽病發(fā)病最嚴(yán)重。殺菌劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，5種殺菌劑對核桃炭疽病菌的抑菌效果為：25%吡唑醚菌酯>45%咪鮮胺>40%苯醚甲環(huán)唑>25%嘧菌酯>43%戊唑醇；田間防治試驗(yàn)結(jié)果顯示，25%吡唑醚菌酯、45%咪鮮胺和40%苯醚甲環(huán)唑?qū)颂姨烤也〉奶镩g防治效果分別為82.23%、80.26%和75.98%?！窘Y(jié)論】核桃炭疽病是目前廣西西北部核桃的主要真菌性病害。25%吡唑醚菌酯可作為防治核桃炭疽病的藥劑使用，同時建議在地勢較高、排水良好且通風(fēng)狀況好的地點(diǎn)種植核桃，以防止病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞： 核桃；真菌病害；炭疽??；殺菌劑；防治效果；廣西西北部

中圖分類號： S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）08-1531-10

0 引言

【研究意義】核桃（Juglans regia）又稱胡桃，是胡桃科核桃屬多年生落葉喬木（孫俊等，2012），被譽(yù)為世界四大干果之一，具有非常高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。核桃在我國栽培歷史悠久，因其適應(yīng)范圍廣、抗逆性強(qiáng)，且核桃果實(shí)產(chǎn)量可觀，因此成為我國第一大干果樹種，同時是我國極受歡迎的藥用植物和經(jīng)濟(jì)樹種（王紅霞等，2007；高智輝等，2009；杜慧平等，2017）。廣西核桃主要在鳳山、樂業(yè)和凌云縣等西北部地區(qū)栽培，這些地方環(huán)境較惡劣，多石山，土壤貧瘠，是廣西典型的石漠化地區(qū)，許多作物無法栽培存活。20世紀(jì)90年代核桃產(chǎn)業(yè)被引進(jìn)廣西，主要用于增加農(nóng)民收入及治理石漠化環(huán)境問題。目前廣西種植的核桃品種有鳳優(yōu)1號、鳳優(yōu)2號、云新核桃、云南漾濞大泡核桃、美國山核桃和山東遼河1號等，但隨著核桃種植面積的擴(kuò)大，核桃病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重，病害嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致核桃樹整株死亡或核桃苗圃整片死亡，已嚴(yán)重影響了核桃產(chǎn)量，因此，對核桃病害進(jìn)行深入調(diào)查及防治方法研究迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】Pollegioni等（2012）報(bào)道核桃褐斑病的病原菌為核桃日規(guī)殼，其無性世代為核桃盤二孢。王安民等（2013）報(bào)道核桃潰瘍病病原菌為腔孢綱球殼孢目的群生小穴殼菌。Zheng等（2015）報(bào)道核桃根腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌。國內(nèi)早期報(bào)道核桃枝枯病的病原菌多為矩圓黑盤孢菌所致的枝枯?。ê鷩嫉?，1992；李會欽，2012；張力元，2017），而戚佩坤等（2007）、孫?。?013）、李星月等（2017）報(bào)道其病原菌為擬莖點(diǎn)霉，尹萬瑞和朱天輝（2016）報(bào)道其病原菌為新殼梭孢。劉曉云等（1995）在陜西留壩、楊凌等地的核桃上曾分離得到尖孢炭疽菌；何興文等（2003）、曲文文等（2011）、黃雄等（2016）、王清海等（2016）鑒定的核桃炭疽病病原菌也為膠孢炭疽菌；Zhu等（2015）分離鑒定得到廣西核桃炭疽病病原菌為松針炭疽菌（Colletotrichum fioriniae）。在核桃炭疽病防治方面，肖育貴等（2010）的研究結(jié)果表明，世高和晴菌唑?qū)颂姨烤也〔≡L的抑制作用較好，林間防治效果可達(dá)85%以上。劉霞等（2013）研究表明，28 ℃時咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對核桃炭疽病病原菌膠孢炭疽菌菌絲毒力最強(qiáng)，而異菌脲、代森錳鋅和咪鮮胺對其孢子的毒力最強(qiáng)。王凡等（2015）測定了9種殺菌劑對核桃炭疽病菌的抑制作用，結(jié)果表明以40%咪鮮胺水乳劑對膠孢炭疽菌的抑菌作用最強(qiáng)。黃雄等（2016）的室內(nèi)防治試驗(yàn)結(jié)果表明，25%咪鮮胺500倍液、50%福美雙500倍液、70%甲基硫菌靈500倍液和100%鏈霉素3000倍液對核桃炭疽菌的防治效果最佳?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為桂西北部分農(nóng)民的重要經(jīng)濟(jì)收入來源，為廣西農(nóng)民收入增長及環(huán)境治理提供了強(qiáng)有效的支持。但目前已報(bào)道的文獻(xiàn)多為核桃種植或栽培等方面的研究（蔣桂雄等，2010；張武貴等，2012；曾紀(jì)維，2014），對核桃病害方面的研究報(bào)道較少，缺乏針對廣西西北部核桃病蟲害調(diào)查及防治等方面的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】為明確廣西西北部核桃真菌性病害的發(fā)生情況，在廣西河池市的鳳山縣、環(huán)江縣、金城江區(qū)和百色市樂業(yè)縣等核桃種植區(qū)開展核桃真菌性病害種類調(diào)查，對其病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行核桃炭疽病防治藥劑室內(nèi)篩選及田間防治試驗(yàn)，篩選出可有效防治核桃炭疽病的藥劑，為核桃病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 調(diào)查地點(diǎn)

于2015～2017年進(jìn)行核桃真菌性病害種類調(diào)查，調(diào)查地點(diǎn)主要集中在廣西西北部的河池市金城江區(qū)、環(huán)江縣、鳳山縣和百色市樂業(yè)縣，調(diào)研多個核桃示范基地，分別是河池市鳳山縣金牙鄉(xiāng)示范基地、環(huán)江縣水源鎮(zhèn)核桃示范基地、金城江區(qū)側(cè)嶺鄉(xiāng)良種繁育基地、金城江區(qū)水任收費(fèi)站核桃示范基地、金城江區(qū)大山塘示范基地、金城江區(qū)齊美村才貴屯核桃示范基地、金城江區(qū)三才村內(nèi)文屯核桃種植地及樂業(yè)縣央林大槽等苗圃。

1. 2 試驗(yàn)材料

此次調(diào)查的核桃品種主要有鳳優(yōu)1號、鳳優(yōu)2號、云新核桃、云南漾濞大泡核桃、美國山核桃、山東遼河1號和香玲核桃等。采集感病植株的葉片、枝條和果實(shí)，帶回實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步試驗(yàn)。

主要儀器設(shè)備：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHZT-9240A型，太倉精宏儀器設(shè)備有限公司），全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-SⅡ型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），光照培養(yǎng)箱（LRH-400-G型，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司），生物光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX21，日本東京奧林巴斯公司），PCR儀[天根生化科技（北京）有限公司]，電泳槽（DYCZ-24A型，北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（購自Bio-Rad公司），DNA提取試劑盒[新型植物基因組DNA提取試劑盒（NuClean PlantGen DNA Kit），康為世紀(jì)生物科技有限公司]。

1. 3 病害田間調(diào)查方法

選擇天氣回暖、高溫、高濕時節(jié)，即核桃病害發(fā)病高峰期開展核桃苗圃真菌性病害調(diào)查及采樣工作。采用線路踏查法進(jìn)行核桃病害種類調(diào)查，具體方法：調(diào)查人員在同一樹種苗圃間行走觀察植株，記載病害發(fā)生的種類、嚴(yán)重程度，采集帶有典型癥狀的樣本，歸類存放，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行分離鑒定。病害發(fā)生嚴(yán)重程度調(diào)查根據(jù)同一樹種苗圃田塊形狀選擇調(diào)查方法及采樣，當(dāng)田塊較大、較規(guī)則時，可采用五點(diǎn)取樣法，每個點(diǎn)為邊長約2 m的正方形；當(dāng)田塊為長條形時，可采用三點(diǎn)法，即兩頭選兩個點(diǎn)、中間選擇一個點(diǎn)；對于不規(guī)則的林場，可采取隨機(jī)抽樣調(diào)查采樣。病害嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）參照方中達(dá)（1998）的方法。

1. 4 病原菌分離及鑒定

1. 4. 1 病原菌分離純化 選取新鮮的帶有典型病斑的核桃葉片或根莖，用解剖刀取病健交界處5 mm×5 mm大小的組織塊，先用75%酒精浸潤10 s，再用0.1%升汞溶液消毒30 s，最后用滅菌水沖洗3次，待組織塊晾干后，將其轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織上長出的菌落產(chǎn)孢后進(jìn)行單孢稀釋純化。

1. 4. 2 病原菌致病性測定 病原菌致病性測定的寄主植物為云南漾濞大泡核桃。將已純化的病原菌用5 mm打孔器打取大小一致的菌絲塊，分別同時進(jìn)行野外植株接種和室內(nèi)離體接種。設(shè)針刺法和無傷口接種兩種處理，以空白瓊脂塊處理為空白對照。每處理均設(shè)3次重復(fù)。室內(nèi)離體接種各處理使用有機(jī)玻璃罩罩住后置于溫室內(nèi)保濕，野外植株接種后使用無菌保鮮袋套袋進(jìn)行保濕，此后每天觀察并記錄發(fā)病情況，待出現(xiàn)癥狀后，根據(jù)柯赫氏法則對發(fā)病部位進(jìn)行病原再分離，若仍能得到相同的菌，即確定其為病原菌。

1. 4. 3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定及rDNA-ITS序列測定

病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將純化后的病原菌菌種在適宜的溫度條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)并逐日觀察記錄病原菌的培養(yǎng)性狀，如菌落大小、顏色、形狀等。采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀測病原菌的菌絲、產(chǎn)孢梗和孢子等的大小及形態(tài)特征。觀察病原菌孢子等的形態(tài)結(jié)構(gòu)時，使用奧林巴斯CX21型生物光學(xué)顯微鏡，先于10倍物鏡視野下觀察，后使用40倍物鏡觀察其孢子等的具體形態(tài)特征；形態(tài)學(xué)鑒定方法參照相關(guān)文獻(xiàn)（魏景超，1982；周茂繁，1989；許志剛，2002）。

病原菌rDNA-ITS序列測定：將純化后的病原菌接種至PDA培養(yǎng)基上，待其生長6～8 d后刮取菌絲提取DNA。將所提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS1：5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（周穎，2016）。PCR反應(yīng)體系25.0 μL，其中包括2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，RNase-Free Water補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，將成像條帶清晰明亮的PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司和康為世紀(jì)生物科技有限公司純化回收后測序。對測定的結(jié)果，采用www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站中的BLAST比對程序進(jìn)行比對分析，查找同源性最高的病原菌序列。根據(jù)病原菌分子序列對比結(jié)果，使用MEGA 7.0、DNAMAN及BioEdit v7.0.5進(jìn)行分析，明確其分類地位。

1. 5 防治藥劑篩選試驗(yàn)

1. 5. 1 供試藥劑 供試劑信息見表2。

1. 5. 2 室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn) 以43%戊唑醇、45%咪鮮胺、25%嘧菌酯、25%吡唑醚菌酯和40%苯醚甲環(huán)唑?yàn)楣┰囁巹栽赑DA培養(yǎng)基上經(jīng)分離純化的病原菌為供試材料。將供試藥劑按計(jì)算好的量加入PDA培養(yǎng)基，配置不同濃度藥劑培養(yǎng)基，向每個培養(yǎng)皿內(nèi)倒入10 mL培養(yǎng)基，以不加藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照，各處理重復(fù)3次。將斜面保存的菌種于無菌的PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后于菌落邊緣處用5 mm打孔器打取大小一致的菌絲塊，將菌絲塊接種至已凝固的藥劑培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基正中央，封口膜封口，于25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每3 d測量一次菌落直徑，直至空白對照組菌落占培養(yǎng)皿的80%。用垂直十字交叉法測量所得各處理的菌落直徑，計(jì)算菌落生長抑制率，并求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和抑制中濃度（EC50）。

1. 5. 3 田間防治試驗(yàn) 在金城江區(qū)齊美村才貴屯核桃示范基地進(jìn)行田間防治試驗(yàn)。選擇2～3年生核桃苗為施藥對象，藥劑選擇45%咪鮮胺1000倍、25%吡唑醚菌酯1000倍和40%苯醚甲環(huán)唑1000倍液，以清水處理為對照（CK）。因試驗(yàn)地為坡地，核桃種植不規(guī)則，因此采取小區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)，每一片集中地區(qū)隨機(jī)設(shè)4個小區(qū)，每小區(qū)對應(yīng)一種藥劑及清水對照，確保同一片集中地區(qū)內(nèi)每種處理核桃株數(shù)一致，每處理4次重復(fù)。每隔15 d噴藥1次，共噴3次，最后一次施藥后15 d調(diào)查其發(fā)病率及病情指數(shù)。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 核桃真菌性病害種類調(diào)查結(jié)果

2. 1. 1 核桃根腐病 危害核桃植株根部，根部腐爛導(dǎo)致病株葉片出現(xiàn)退綠、黃化和萎蔫等癥狀，嚴(yán)重時導(dǎo)致整株死亡，淹水后容易發(fā)病（圖1）。此病只在金城江區(qū)三才村內(nèi)文屯種植地、金城江區(qū)大山塘示范基地（山地種植）、鳳山縣金牙鄉(xiāng)示范基地和樂業(yè)縣央林大槽發(fā)生，多數(shù)只有1～2株發(fā)病。除金城江區(qū)三才村內(nèi)文屯種植地外，其他調(diào)查點(diǎn)核桃根腐病發(fā)病率均低于5.00%以下；金城江區(qū)三才村內(nèi)文屯種植地核桃根腐病發(fā)病率高達(dá)53.85%，因該地地處山內(nèi)盆地，地勢較低，接連陰雨造成大面積淹水，導(dǎo)致根腐病發(fā)生嚴(yán)重。

分離得到一株優(yōu)勢菌株HTGF-1，分離率為64%。將該菌進(jìn)行純培養(yǎng)后，取5 mm菌絲塊接種于健康的核桃根系，利用柯赫氏法則確定HTGF-1菌株為核桃根腐病病原菌。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初期為白色絮狀菌絲，后期菌落背面產(chǎn)生黑色色素。其病原菌有兩種形態(tài)的分生孢子，小型分生孢子呈卵形，無隔或只有1個分隔，大小為10.05±2.50 μm×7.6±0.50 μm；大型分生孢子呈鐮刀形，有1～3個隔，兩端鈍圓，大小為43.35±6.30 μm×5.4±0.20 μm（圖2）。根據(jù)其分生孢子的鐮刀狀初步判定為鐮刀菌屬真菌，經(jīng)rDNA-ITS序列測定后，與GenBank中的Fusarium solani （KJ528277.1）同源性達(dá)99%，進(jìn)而確定核桃根腐病病原菌為腐皮鐮刀菌（F. solani）。

2. 1. 2 核桃枝枯病 主要危害小枝，尤以1～2年生枝條為主，開始時病原菌多從頂梢幼嫩的斷枝進(jìn)行侵染，隨后逐漸向下侵染直至主干。侵染初期時枝條呈暗灰褐色，稍凹陷，病健交界處的健康組織常稍隆起，后逐漸變?yōu)闇\紅褐色，最后變?yōu)樯罨疑?。病部皮層壞死、干縮，很快擴(kuò)展繞枝條一周，造成枝枯，其上葉片逐漸變黃脫落。病死枯枝上散生很多黑色小顆粒，直徑0.2～0.3 mm，為其病原菌的分生孢子器，濕度大時，分生孢子器上會重新分泌出分生孢子堆（圖3）。調(diào)查結(jié)果顯示，核桃枝枯病病害級數(shù)1～4級不等，發(fā)病嚴(yán)重的全株80.00%感染致使植株死亡。在金城江區(qū)三才村內(nèi)文屯、金城江區(qū)大山塘示范基地、環(huán)江縣水源鎮(zhèn)核桃示范基地、樂業(yè)縣央林大槽等地發(fā)病率為25.00%～40.00%，其中樂業(yè)縣央林大槽發(fā)病率最高，為37.50%。

將感病組織帶回實(shí)驗(yàn)室后對發(fā)病部位進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)病原菌分生孢子器扁球形，單腔，保濕培養(yǎng)一段時間后會從其上溢出分生孢子。取感病部位進(jìn)行分離，得到一株優(yōu)勢菌株ZK6-4。將ZK6-4菌株接種于健康枝條后感病，并從感病部位分離得到該菌株，確定其為核桃枝枯病病原菌。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為白色，后期顏色逐漸加深變?yōu)闇\褐色絮狀菌落，分生孢子器為黑色埋生在基質(zhì)中。病原菌的分生孢子有兩種不同形態(tài)，α型分生孢子無色，單孢，長橢圓形或近紡錘形，兩端鈍圓，大小為9.05±3.50 μm×3.2±0.10 μm；β型分生孢子無色，單孢，線性，直或一端稍彎，大小為32.30±8.40 μm×1.0 μm（圖4）。經(jīng)rDNA-ITS序列測定，并進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)ZK6-4菌株與Phomopsis juglandina（KU837233.1）菌株同源性最高，達(dá)100%，因此鑒定核桃枝枯病病原菌為胡桃楸擬莖點(diǎn)霉（P. juglandina）。

2. 1. 3 核桃莖點(diǎn)霉黑斑病 主要危害葉片、莖和果實(shí)。在葉片上形成褐色至黑色圓形或不規(guī)則病斑，嚴(yán)重時連接成片，導(dǎo)致病葉萎縮畸形；在莖上形成長條形黑褐色病斑，稍凹陷，蔓延后會圍繞枝條一圈致其枯死；在果實(shí)表面出現(xiàn)黑色小病斑，后逐漸擴(kuò)大并呈不規(guī)則的下陷斑，最終導(dǎo)致果實(shí)壞死脫落（圖5）。在鳳山和樂業(yè)等有果實(shí)地區(qū)發(fā)病率為40.00%，金城江區(qū)大山塘示范基地、金城江區(qū)水任收費(fèi)站核桃示范基地、金城江區(qū)側(cè)嶺鄉(xiāng)良種繁育基地和環(huán)江縣水源鎮(zhèn)核桃示范基地等發(fā)病率為10.00%～15.00%，核桃果實(shí)感染核桃莖點(diǎn)霉黑斑病后80.00%以上的果實(shí)腐爛死亡，但只為害青皮部分，核桃枝干及葉片感染核桃莖點(diǎn)霉黑斑病的死亡率只有23.00%。

采集感病果實(shí)及枝條帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，獲得2株優(yōu)勢菌株HT3-1和HT4-2，分離率分別為23.3%和19.7%。將所得菌株純化后取5 mm菌絲塊接種至健康核桃果實(shí)上，根據(jù)柯赫氏法則判定2株菌株均為該病的病原菌。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上初為白色，后菌落中央漸呈褐色至黑色。分生孢子器散生或聚生，梨形，有一個乳突狀孔口；分生孢子無色，單孢，為圓筒形或近圓筒形，大小為6.25±1.20 μm×2.34±0.10 μm（圖6）。經(jīng)rDNA-ITS序列測定，與GenBank中的莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）多個種如Phoma sp.（FJ827141）、P. herbarum（N903924）、P. bellidis（JF502444）和P. glomera-ta（FJ481024）等的同源性均在95%以上，因此鑒定HT3-1和HT4-2菌株為莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）真菌。

2. 1. 4 核桃炭疽病 是廣西西北部最主要的核桃真菌病害，此病危害葉片、枝條和果實(shí)，以葉片發(fā)病較嚴(yán)重，枝條及果實(shí)次之。果實(shí)上的病斑黑色，圓形或近圓形，葉片上的病斑褐色至黑色，不規(guī)則，后期中間灰白形成穿孔，有時呈長條形（圖7）。發(fā)病枝條形成不規(guī)則或長條形或圓形凹陷的黑褐色病斑，嚴(yán)重時連接成片導(dǎo)致枝條壞死。發(fā)病后期，果實(shí)壞死形成僵果脫落，葉片呈焦枯狀，新梢枯萎，濕度大時，病斑上小黑點(diǎn)溢出橙色分生孢子團(tuán)。

對感染核桃炭疽病的葉片、枝條和果實(shí)的感病部位進(jìn)行分離，得到5株菌株：TA3-4、TB5-2、TB5-3、TA3-1和TB3-1，經(jīng)回接試驗(yàn)后再分離確定5株菌株均為核桃炭疽病病原菌。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲初為白色，后逐漸變成深灰色、黑灰色甚至黑色，培養(yǎng)基正反面顏色不一，反面顏色深于正面。培養(yǎng)后期會在菌絲表面形成橘紅色點(diǎn)狀孢子堆，后孢子堆變黑，孢子溢出極易萌發(fā)。分生孢子無色，單胞，圓柱形，兩端鈍圓或一端略尖或中間微凹陷，以圓柱形兩頭鈍圓為主，大小為11.05±2.50 μm×5.6±0.20 μm（圖8）。經(jīng)rDNA-ITS序列測定，與GenBank中的Colletotrichum gloeosporioides的幾個序列高度相似，如與序列號KC172072.1的C. gloeosporioides同源性為99%，與序列號GQ407097.1的C. gloeosporioides同源性為99%，與序列號MF554888.1的C. gloeosporioides同源性為97%，與序列號MF554879.1的C. gloeospo-rioides同源性為96%，因此可將核桃炭疽病病原菌鑒定為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

2. 2 核桃炭疽病發(fā)生情況調(diào)查結(jié)果

對各地多個核桃品種的炭疽病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果（表3）表明，核桃炭疽病在廣西西北部普遍發(fā)生，發(fā)病率在20.00%～100.00%，其中鳳山縣金牙鄉(xiāng)示范基地、樂業(yè)縣央林大槽和金城江區(qū)大山塘示范基地的發(fā)病率均高達(dá)90.00%以上，最高可達(dá)100.00%；其病情指數(shù)在5.00～89.67，以樂業(yè)縣央林大槽和金城江區(qū)齊美村才貴屯示范基地發(fā)病嚴(yán)重，病情指數(shù)分別為89.67和62.05。不同品種的發(fā)病嚴(yán)重程度差異明顯，以香玲核桃發(fā)病最嚴(yán)重，其病情指數(shù)高達(dá)89.67，鐵核桃的病情指數(shù)只有5.00和10.00，發(fā)病最輕，鳳優(yōu)1號、云南漾濞大泡、美國山核桃、云新核桃和山東遼河1號等5個品種病情指數(shù)相近。

2. 3 核桃炭疽病室內(nèi)藥劑篩選及田間防治試驗(yàn)結(jié)果

2. 3. 1 室內(nèi)藥劑篩選 選擇核桃炭疽病菌中分離率最高的3株菌株TA3-4、TB5-2和TB5-3進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選。結(jié)果（表4）顯示，5種殺菌劑對TA3-4和TB5-2菌株的抑制效果接近，EC50最小為0.0561和0.0605 mg/L，對TB5-3菌株的抑制效果略有差異，EC50最小為0.4674。5種殺菌劑抑菌效果由強(qiáng)至弱總體排序?yàn)椋?5%吡唑醚菌酯>45%咪鮮胺>40%苯醚甲環(huán)唑>25%嘧菌酯>43%戊唑醇。

2. 3. 2 田間防治試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)室內(nèi)篩選結(jié)果，選擇殺菌效果較優(yōu)的3種殺菌劑（25%吡唑醚菌酯、45%咪鮮胺和40%苯醚甲環(huán)唑）進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，結(jié)果（表5）表明，3種殺菌劑對核桃炭疽病的田間防效均在75.00%以上，其中，25%吡唑醚菌酯的抑菌效果最佳，對核桃炭疽病的防治效果達(dá)82.23%；45%咪鮮胺次之，防治效果為80.26%；40%苯醚甲環(huán)唑最弱，防治效果為75.98%。與對照相比，3種殺菌劑均在一定程度上降低了核桃炭疽病的發(fā)病率，具體排序?yàn)?5%咪鮮胺>25%吡唑醚菌酯>40%苯醚甲環(huán)唑，與各藥劑防治效果的排序略有不同，在抑制核桃炭疽病的發(fā)生方面，45%咪鮮胺的效果最佳。綜合考慮，以25%吡唑醚菌酯對核桃炭疽病的防治效果最佳。

3 討論

3. 1 核桃真菌性病害的病原

本研究對廣西西北部核桃真菌性病害種類及發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地域核桃真菌性病害主要有核桃根腐病、核桃枝枯病、核桃莖點(diǎn)霉黑斑病和核桃炭疽病。其中，核桃根腐病的病原菌為腐皮鐮刀菌（F. solani），與Zheng等（2015）的研究結(jié)果一致，而與胡云飛和郭新峰（2011）報(bào)道其病原菌為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）及瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）存在差異；核桃枝枯病病原菌為胡桃楸擬莖點(diǎn)霉（P. juglandina），與孫?。?013）的研究結(jié)果一致，而與胡國良等（1992）、張力元（2017）報(bào)道其病原菌為矩圓黑盤孢菌（Melanconium oblongum）、李星月等（2017）報(bào)道其病原菌為擬莖點(diǎn)霉（P. capsici）存在差異；核桃莖點(diǎn)霉黑斑病病原菌為莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）真菌，與熊婉（2013）的研究結(jié)果一致，該病害目前除廣西西北部外，僅在湖北宜昌發(fā)現(xiàn)并報(bào)道過；核桃炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），與曲文文等（2011）、黃雄等（2016）、王清海等（2016）的研究結(jié)果一致，而Zhu等（2015）報(bào)道核桃炭疽病病原菌為C. fioriniae，該菌可能是稀有菌株，本次調(diào)查未找到該菌。本研究鑒定所得病原菌與前人研究結(jié)果存在一定差異，可能是因?yàn)檎{(diào)查地點(diǎn)、環(huán)境氣候及核桃品種的不同導(dǎo)致侵染核桃的病原菌不同，后續(xù)應(yīng)針對廣西西北部地理環(huán)境特點(diǎn)對病害發(fā)生規(guī)律進(jìn)行深入研究。

3. 2 核桃病害的防治

劉霞等（2013）、王清海等（2016）測定了不同藥劑對核桃炭疽病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)咪鮮胺是核桃炭疽病較理想的防治藥劑。本研究開展了核桃炭疽病菌室內(nèi)藥劑篩選和田間防效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯是較理想的核桃炭疽病防治藥劑，其在廣西西北部的防治效果較優(yōu)于咪鮮胺。由調(diào)查所得數(shù)據(jù)可知，應(yīng)避免在地勢低洼、排水不暢處種植核桃，以避免核桃根部浸水腐爛導(dǎo)致死亡，且在苗圃中栽種核桃時應(yīng)注意樹與樹之間的距離，保證林間通風(fēng)能有效預(yù)防病害發(fā)生?；瘜W(xué)防治雖然有效，但病原菌經(jīng)農(nóng)藥刺激后會產(chǎn)生抗藥性，因此在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)加強(qiáng)物理防治及生物防治的研究，找尋可持續(xù)發(fā)展的核桃病害防治方法。

4 結(jié)論

本研究對廣西西北部核桃真菌性病害種類及發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地域核桃真菌性病害主要有核桃根腐病、核桃枝枯病、核桃莖點(diǎn)霉黑斑病和核桃炭疽病4種，確定其病原菌分別為腐皮鐮刀菌（F. solani）、胡桃楸擬莖點(diǎn)霉（P. juglandina）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma sp.）真菌和膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides），其中核桃炭疽病為主要病害。針對核桃炭疽病的防治，篩選出25%吡唑醚菌酯的效果最佳，可用于廣西西北部核桃炭疽病防治。今后，應(yīng)加強(qiáng)對核桃苗圃的規(guī)范管理，選擇地勢較高、排水良好且通風(fēng)狀況好的地點(diǎn)種植核桃，以防止病害發(fā)生。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）