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      擬環(huán)紋豹蛛熱休克蛋白20基因的克隆與分析

      2018-09-10 19:19:32李長春王永姚國新戴余軍李國元
      南方農(nóng)業(yè)學(xué)報 2018年8期
      關(guān)鍵詞:熒光定量PCR基因克隆

      李長春 王永 姚國新 戴余軍 李國元

      摘要:【目的】克隆擬環(huán)紋豹蛛熱休克蛋白20基因(HSP20),并分析其在鎘脅迫下的表達(dá)情況,為揭示蜘蛛抵御重金屬脅迫機(jī)制提供參考?!痉椒ā恳詳M環(huán)紋豹蛛雌蛛為試驗(yàn)材料,在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,通過RT-PCR克隆擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因(PpHSP20),用生物信息學(xué)方法對其序列特征進(jìn)行分析,并采用熒光定量PCR檢測鎘脅迫下PpHSP20基因的相對表達(dá)量?!窘Y(jié)果】克隆獲得的PpHSP20基因編碼區(qū)長525 bp,編碼174個氨基酸,其編碼蛋白分子量20.08 kD,等電點(diǎn)5.97,具有小分子熱休克蛋白家族典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域,與溫室擬肥腹蛛(Parasteatoda tepidariorum)α-晶體蛋白A有較高的相似性(58%)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,鎘脅迫下PpHSP20基因的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)?!窘Y(jié)論】擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因在抵御鎘脅迫中發(fā)揮調(diào)控作用,可作為研究蜘蛛抵御鎘脅迫的重要候選基因和潛在的生物標(biāo)記物。

      關(guān)鍵詞: 擬環(huán)紋豹蛛;HSP20基因;基因克?。粺晒舛縋CR

      中圖分類號: S186;Q956 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:2095-1191(2018)08-1525-06

      0 引言

      【研究意義】小分子熱休克蛋白(Small heat shock protein, sHSP)是自然界中含量最豐富的一類分子伴侶,在動植物和微生物中廣泛存在,除參與細(xì)胞正常生理活動外,在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下高效表達(dá),對抵御環(huán)境脅迫具有重要作用(Hilton et al., 2013; King and Macrae, 2015)。環(huán)境重金屬污染是一種普遍現(xiàn)象,在我國以農(nóng)田鎘污染尤為突出,部分污染區(qū)土壤鎘含量遠(yuǎn)高于現(xiàn)行《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618—1995)規(guī)定的限量值,對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成了嚴(yán)重威脅(Wei and Yang, 2010; He et al., 2013)。蜘蛛普遍存在于各種生境中,其種類多、數(shù)量大、繁殖快(申效誠等,2013)。近年來,人們發(fā)現(xiàn)活躍的游獵型蜘蛛可積累并耐受高濃度的鎘,是環(huán)境毒理學(xué)研究的理想材料(Shao et al., 2006; Yang et al., 2016)。擬環(huán)紋豹蛛(Pardosa pseudoannulata)在我國農(nóng)田廣泛分布,是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲天敵(Lou et al., 2013)。因此,研究擬環(huán)紋豹蛛小分子熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,對明確蜘蛛抵御重金屬等環(huán)境脅迫的機(jī)制,以及利用蜘蛛作為重金屬污染指示生物等均具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】熱休克蛋白(Heat shock protein, HSP)是生物體受到刺激后大量合成、結(jié)構(gòu)高度保守的應(yīng)激蛋白,在細(xì)胞抵御環(huán)境脅迫及維持正常功能過程中發(fā)揮重要作用(黃建芳等, 2015)。根據(jù)分子量大小、結(jié)構(gòu)和功能,HSP通常被分為6個家族,即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSP(Snoeckx et al.,2001)。其中,sHSP的分子量一般在12~43 kD,結(jié)構(gòu)上沒有其他家族保守,但具有共同的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin, ACD)(Van et al., 2001)。近年來,已在果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)、中華稻蝗(Oxya chinensis)和斜紋夜蛾(Spodoptera litura)等昆蟲中開展了sHSP結(jié)構(gòu)和功能的研究(寇利花等, 2015)。Morrow等(2004)研究發(fā)現(xiàn),果蠅線粒體HSP22蛋白能保護(hù)其線粒體中其他蛋白和影響其衰老進(jìn)程,HSP22的過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)其抵御氧化損傷的能力。Liu等(2013)從柞蠶(Anthe-raea pernyi)體內(nèi)克隆獲得一個編碼186個氨基酸的HSP21,并通過RT-qPCR和Western印跡法證明其在柞蠶熱耐受過程中發(fā)揮重要作用。You等(2014)研究發(fā)現(xiàn),紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)sHSP24.1基因的表達(dá)量隨鎘濃度的增加和脅迫時間的延長先升高后降低,推測sHSPs在鎘初始脅迫時發(fā)揮了保護(hù)作用,應(yīng)激后則蟲體內(nèi)其他解毒系統(tǒng)開始發(fā)揮作用。寇利花等(2015)用不同濃度Cd2+對中華稻蝗5齡若蟲染毒處理后,利用RT-qPCR進(jìn)行定量檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其精巢和卵巢中5個sHSP基因在鎘急性誘導(dǎo)下以不同的模式表達(dá),表達(dá)量與鎘的濃度和作用時間有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)重金屬鎘可在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)大量富集,并對其生長繁殖和生理代謝產(chǎn)生顯著影響(Li et al., 2016a),但對蜘蛛抵御重金屬脅迫的具體機(jī)制了解不多,有關(guān)擬環(huán)紋豹蛛sHSP基因序列分析和鎘脅迫下差異表達(dá)的研究尚無報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在借助高通量測序技術(shù)獲得的擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上(Li et al., 2016b),篩選出HSP20基因拼接序列,采用RT-PCR獲得其全長cDNA序列,用在線生物信息學(xué)方法對其序列特征進(jìn)行分析,并采用熒光定量PCR檢測0.2和2.0 mmol/L CdCl2脅迫下HSP20基因的相對表達(dá)量,為深入揭示蜘蛛抵御重金屬脅迫機(jī)制提供參考。

      1 材料與方法

      1. 1 試驗(yàn)材料

      擬環(huán)紋豹蛛亞成蛛采自武漢馬鞍山森林公園(東經(jīng)114°31′,北緯30°52′),單頭置于試管后放入人工氣候箱中飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(26±1)°C、相對濕度70%、光照周期14 L∶10 D。參考前期研究,在雌蛛成熟2 d后,用0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液進(jìn)行飲用水染毒處理,以ddH2O為對照。每處理3個生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)不少于6頭蜘蛛(Li et al.,2016a, 2016b)。處理7 d后液氮速凍保存?zhèn)溆谩?/p>

      RNA提取試劑盒、PrimerScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser基因組DNA去除及反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs Mixture、Ex Taq酶和DL2000 DNA Marker購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司;EasyPure? Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、pEASY?-T1 Cloning Kit克隆載體、Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;SanPrep柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Gray-96G基因擴(kuò)增儀購自上海山富科學(xué)儀器有限公司;Bio-Best 200M凝膠成像系統(tǒng)購自美國西蒙公司;ViiaTM 7實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

      1. 2 試驗(yàn)方法

      1. 2. 1 RNA提取及cDNA合成 參照SanPrep柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒說明提取擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

      1. 2. 2 HSP20基因擴(kuò)增 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因(PpHSP20)序列用Primer 5.0設(shè)計引物[HSP20-F(5'-GCGACTCGGGTTGAAAAAGCTG-3')和HSP20-R(5'-TTCACTGGTCGTCCC

      CTTTTAATG-3')],以擬環(huán)紋豹蛛cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 μL,其中cDNA模板1.0 μL,10×PCR Buffer 2.0 μL,MgC12(25 mmol/L)1.6 μL,dNTPs Mixture(10 μmol/L)1.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,DNA聚合酶0.2 μL,ddH2O 12.2 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

      1. 2. 3 基因克隆與測序 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,EasyPure? Quick Gel Extraction Kit回收后連接克隆載體pEASY?-T1 Cloning Kit,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞,氨芐青霉素篩選陽性克隆。陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

      1. 2. 4 生物信息學(xué)分析 用NCBI BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行BlastP分析,采用在線軟件NCBI ORF Finder分析克隆基因的開放閱讀框(ORF),用ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析編碼蛋白質(zhì)的分子式、分子量和等電點(diǎn)等,用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)分析該蛋白序列的疏水性,用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測蛋白序列的三級結(jié)構(gòu),采用MEGA 5.2中的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,其中Bootstrap值設(shè)為1000。

      1. 2. 5 Cd脅迫下PpHSP20基因表達(dá)分析 以0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作飲用水處理擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛7 d后,合成處理組和對照組蜘蛛的cDNA作熒光定量PCR檢測模板。用Primer 5.0設(shè)計定量分析引物,[PpHSP20-F(5'-CCGGAAGAACTGCAGGTGAAGGT-3')和PpHSP20-R(5'-CGTCGTTTCGTTCCTCGTGCTT-3')],參照SYBR Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus, ROX plus)說明進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系20.0 μL,其中SYBR Premix Ex Mix 10.0 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.4 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,進(jìn)行40個循環(huán);60~95 ℃用于標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,內(nèi)參引物為:β-actin-F(5'-TGTCGCCTTGGACTTTGAGC-3')和β-actin-R(5'-CATTGCCGATGGTGATAACT-3')。反應(yīng)結(jié)束后,用2-ΔΔCt法計算處理組和對照組各基因的表達(dá)水平。不同濃度鎘脅迫下PpHSP20基因表達(dá)量差異用Students-t檢驗(yàn),采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

      2 結(jié)果與分析

      2. 1 PpHSP20基因擴(kuò)增結(jié)果

      在前期對擬環(huán)紋豹蛛轉(zhuǎn)錄組測序和組裝的基礎(chǔ)上,挑選一條被注釋為HSP20/α-晶體蛋白家族的unigene(c98797.graph_c0)。根據(jù)該序列設(shè)計的特異性引物,以擬環(huán)紋豹蛛雌成蛛總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測圖譜(圖1)顯示,約在700 bp處擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物后克隆到pEASY?-T1 Cloning Kit克隆載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞。將菌落PCR篩選的陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序,所得序列長度為716 bp,經(jīng)Genetool比對顯示堿基序列與轉(zhuǎn)錄組測得堿基序列一致,命名為PpHSP20。

      2. 2 PpHSP20基因及其推導(dǎo)氨基酸的序列分析結(jié)果

      將獲得的序列在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行在線分析,結(jié)果(圖2)表明,所克隆的PpHSP20基因包含一個525 bp的完整ORF,編碼174個氨基酸。利用NCBI BLASTp檢索PpHSP20基因編碼蛋白的氨基酸序列,分析結(jié)果表明,擬環(huán)紋豹蛛HSP20與溫室擬肥腹蛛(Parasteatoda tepidariorum) α-晶體蛋白A(XP_015904099.1)和桔小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)HSP21.6(ARQ14800.1)具有較高的相似性,分別為58%和51%。

      2. 3 PpHSP20基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

      利用NCBI Conserved Domains在線軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)PpHSP20蛋白具有典型的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域,由約80個氨基酸組成,含有12個預(yù)測的二聚體形成接觸位點(diǎn),且同源區(qū)域?qū)儆贖sps-p23樣超家族。利用GenBank的ProtParam在線軟件預(yù)測擬環(huán)紋豹蛛HSP20的分子式為C885H1366N252O270S7,分子量為20.08 kD,等電點(diǎn)為5.97,包含20種氨基酸,蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)分別為58.61,為不穩(wěn)定蛋白。

      PredictProtein預(yù)測擬蛋白的二級結(jié)構(gòu),其中PpHSP20蛋白無規(guī)則卷曲占比為58.62%,延伸鏈占比為27.01%,α-螺旋占比為14.37%。SWISS-MODEL預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)表明,PpHSP20編碼的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中蛋白4ydz.1.B匹配相似度為39.22%,匹配氨基酸數(shù)目為65~165個,GMQE值為0.41,QMEAN值為-1.34。ProtScale預(yù)測發(fā)現(xiàn)擬環(huán)紋豹蛛PpHSP20蛋白第105位氨基酸親水性最強(qiáng),平均分值為-0.679,表明為親水性蛋白(圖4)。

      將PpHSP20蛋白序列與家蠶(Bombyx mori) HSP20.4(NP_001037038.1)、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)HSP19.8(OWR44131.1)、蘋果蠹蛾(Cy-dia pomonella)HSP19.8(ADX96000.1)、梨小食心蟲(Grapholita molesta)HSP21.4(AKS40075.1)、美洲斑潛蠅(Liriomyza sativae)HSP21.7(ABE57139.1)、南美斑潛蠅(Liriomyza huidobrensis)HSP20(ABE57137.1)、長尾水青蛾(Actias selene)HSP20.8(ALI87024.1)和溫室擬肥腹蛛 HSP beta-1-like(XP_015921832.1)等節(jié)肢動物的sHSP氨基酸序列進(jìn)行多重比較,利用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)擬環(huán)紋豹蛛HSP20與溫室擬肥腹蛛HSP beta-1-like聚為一小支,并與鱗翅目的黑脈金斑蝶和蘋果蠹蛾兩個HSP19.8聚為一類,而雙翅目的2種斑潛蠅聚為一小支后,與其他幾種鱗翅目的昆蟲聚為一類。

      [ L.sativae Hsp21.7 ][ L.huidobrensis Hsp20 ][ A.selene HSP20.8 ][ B.mori HSP20.4][ G.molesta HSP21.4][ P.pseudoannulata HSP20][ P.tepidariorum HSP beta-1-like ][ D.plexippus HSP19.8][ C.pomonella HSP19.8 ][100][100][70][58][48][47][0.2]

      2. 4 鎘脅迫下PpHSP20基因的表達(dá)分析結(jié)果

      通過熒光定量PCR分析雌成蛛PpHSP20基因在0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作飲用水處理7 d的表達(dá)情況,結(jié)果(圖6)顯示,在0.2和2.0 mmol/L CdCl2脅迫下PpHSP20基因的相對表達(dá)量明顯提高,分別是對照組的4.5和7.9倍。2.0 mmol/L CdCl2處理下PpHSP20基因相對表達(dá)量顯著高于0.2 mmol/L CdCl2處理組(P<0.05),表明鎘脅迫誘導(dǎo)了擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)HSP20基因的表達(dá)。

      3 討論

      sHSP家族保守性不如Hsp70和Hsp90等其他熱休克蛋白家族,其至少包括9個亞類,且所有sHSP的C端均含有一個80~100個氨基酸的α-晶狀體蛋白保守結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通常含有7~8個反相平行的β-折疊片,在分子識別和分子伴侶功能上發(fā)揮重要作用,是鑒定sHSP家族成員的重要特征,在分子進(jìn)化分析上也具有重要意義(Van et al., 2001; Sun and MacRae,2005)。本研究從擬環(huán)紋豹蛛中克隆獲得HSP20的cDNA序列,通過Protein BLAST工具分析,預(yù)測的擬環(huán)紋豹蛛HSP20第65個氨基酸與第147個氨基酸間具有sHSP典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域,并與溫室擬肥腹蛛α-晶狀體蛋白A、桔小實(shí)蠅HSP21.6序列具有較高的相似性,表明所獲得的序列為擬環(huán)紋豹蛛小分子熱休克蛋白基因。在PpHSP20蛋白的ACD區(qū)域含有12個預(yù)測的二聚體形成接觸位點(diǎn),可能與PpHSP20單體二聚體化有關(guān)。二聚體是sHSP形成多聚體的基本單位,而sHSP以多聚體形式執(zhí)行生物學(xué)功能為特征(Dudich et al.,1995;Brophy et al., 1999)。

      重金屬進(jìn)入細(xì)胞后能直接或間接破壞胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)(Stadtman and Levine, 2003; Rani et al., 2014)。sHSP作為分子伴侶,可與脅迫造成的非正常蛋白結(jié)合,防止它們彼此聚集(Nakamoto and Vigh,2007)。已有研究表明,重金屬等環(huán)境壓力會引起生物體sHSP基因表達(dá)的改變(Sun and MacRae, 2005)。4種不同的片腳類動物Gmelinoides fasciatus、Eulimnogammarus cyaneus、E. vittatus和Ommatogammarus flavu在鎘脅迫下其sHSP基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)的趨勢(Shatilina et al., 2010)。扇貝(Argopecten irradians)在Cu2+、Pb2+和Cd2+處理10 d后HSP22表達(dá)量顯著上調(diào)(Zhang et al., 2010)。黑鯽(Carassius carassius)腎臟中HSP30表達(dá)水平與水質(zhì)變化一致,表明腎臟HSP30的表達(dá)可作為環(huán)境水質(zhì)變化的生物標(biāo)記(An et al., 2014)。鎘是我國農(nóng)田主要的重金屬污染物,對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成了嚴(yán)重威脅(He et al., 2013)。本研究中鎘脅迫下擬環(huán)紋豹蛛HSP20表達(dá)量明顯增加,可能與因鎘脅迫造成的結(jié)構(gòu)異常蛋白質(zhì)結(jié)合,從而在環(huán)境壓力緩解后,在其他熱休克蛋白幫助下促使這些蛋白重新折疊成正常結(jié)構(gòu)(Nakamoto and Vigh, 2007)。

      4 結(jié)論

      擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因編碼區(qū)長525 bp,編碼蛋白含174個氨基酸殘基,理論分子量20.08 kD,等電點(diǎn)5.97,具有親水性和小分子熱休克蛋白家族典型的α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析顯示鎘脅迫下擬環(huán)紋豹蛛HSP20基因表達(dá)量顯著增加,表明其在抵御鎘脅迫中發(fā)揮作用,可作為研究蜘蛛抵御鎘脅迫的重要候選基因和潛在的生物標(biāo)記物。

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      (責(zé)任編輯 麻小燕)

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