王慧 楊文佳 駱建林 李國(guó)勇 張婷 白禹 李燦

摘要：【目的】探究大鯢（Andrias davidianus）抗菌肽家族基因?qū)κ人畾鈫伟ˋeromonas hydrophila）侵染的響應(yīng)，為揭示抗菌肽家族基因的功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^腹腔注射嗜水氣單胞菌感染大鯢后，采用Trizol提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析抗菌肽家族3個(gè)基因（KK1、KK5和KK8）在大鯢皮膚和肝臟器官的表達(dá)響應(yīng)情況?！窘Y(jié)果】經(jīng)腹腔注射嗜水氣單胞菌后，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8在大鯢皮膚組織中的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～36 h均顯著高于注射PBS的對(duì)照組（P<0.05，下同）；而在肝臟組織中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相對(duì)表達(dá)量分別在攻毒后24、12和24 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，其他時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，說明這3個(gè)抗菌肽基因在早期積極響應(yīng)嗜水氣單胞菌的侵染，但相對(duì)于皮膚組織，其高表達(dá)量持續(xù)時(shí)間較短?！窘Y(jié)論】抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水氣單胞菌侵染大鯢時(shí)積極作出應(yīng)答，尤其在皮膚組織中的特異表達(dá)對(duì)啟動(dòng)機(jī)體天然免疫應(yīng)答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

關(guān)鍵詞：大鯢；嗜水氣單胞菌；抗菌肽；響應(yīng)；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S947.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）08-1627-06

0 引言

【研究意義】抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）廣泛存在于多種生物體內(nèi)，且種類繁多，是生物體非特異性免疫功能的重要組成部分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種生物學(xué)功能，尤其在生物體的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用（Bals et al.，1998；單安山等，2012；王青等，2016），即AMPs在疾病診療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。因此，了解AMPs對(duì)揭示病原感染免疫應(yīng)答機(jī)制及制定有效控制措施具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】AMPs是免疫系統(tǒng)防御病原微生物入侵的一個(gè)重要組分，具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性及廣譜抗菌等特點(diǎn)，一度被認(rèn)為是新型的藥物試劑。已有研究表明，成熟的AMPs具有廣譜抗菌活性以抵抗細(xì)菌、病毒和真菌的侵染（Ko?ciu-czuk et al.，2012；Gao et al.，2015；Wei et al.，2015）。AMPs作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜上形成跨膜的離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄露而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。除此之外，AMPs在寄主的每個(gè)生命活動(dòng)階段均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)傷口愈合，或激活免疫細(xì)胞以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)（Nagaoka et al.，2001；Zuyderduyn et al.，2001；Bowdish et al.，2004）。兩棲類動(dòng)物的AMPs主要存在于皮膚、胃黏膜和小腸細(xì)胞中。田曉樂（2004）研究證實(shí)，在非洲爪蟾皮膚和胃黏膜腺體上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的蛙皮素（Magai-nins），其微克分子濃度即可殺滅革蘭氏陽、陰性細(xì)菌及真菌和原生動(dòng)物，甚至可在不傷害體細(xì)胞或紅細(xì)胞的情況下殺死腫瘤細(xì)胞。鄒黎黎（2008）報(bào)道，林棲蛙皮膚抗菌肽demasepin 1是由34個(gè)氨基酸殘基組成的陽離子親水脂多肽，對(duì)不同致病微生物包括細(xì)菌、酵母、原生動(dòng)物和絲狀真菌均具有抑制活性。Lu和Chen（2010）研究發(fā)現(xiàn)，歐亞蛙和北美蛙的esculentin-l、ranalexin-l和ranatuerin具有廣譜的抗細(xì)菌和抗真菌活性，且呈低溶血活性。與其他兩棲類動(dòng)物一樣，大鯢皮膚含有豐富的生物活性肽，如抗菌肽和抗氧化肽等（Suraprasit et al.，2014；Xu and Lai，2015；Yang et al.，2017）。【本研究切入點(diǎn)】大鯢（Andrias davidianus）隸屬于有尾目（Caudata）隱鰓鯢科（Cryptobranchidae）大鯢屬（Andrias），是現(xiàn)存兩棲類動(dòng)物中個(gè)體最大、最珍貴的物種，被認(rèn)定為國(guó)家二級(jí)野生保護(hù)動(dòng)物（周小愿等，2012）。由于大鯢地位的特殊性及原始結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，已成為當(dāng)前研究生物進(jìn)化、物種多樣性、性別決定分子機(jī)制等科學(xué)問題的理想材料（崔丹等，2017），但目前針對(duì)大鯢抗菌肽的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過腹腔注射嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）感染大鯢后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析抗菌肽家族3個(gè)基因（KK1、KK5和KK8）在大鯢皮膚和肝臟器官的表達(dá)響應(yīng)情況，為研究大鯢抗菌肽家族基因?qū)?xì)菌性病害的免疫功能及其抗病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年9月～2018年2月在貴陽學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院完成。嗜水氣單胞菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，大鯢幼苗購(gòu)自貴州省黔夢(mèng)科技有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試驗(yàn)菌懸液配制 將嗜水氣單胞菌接種于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD600=0.6，對(duì)應(yīng)的菌懸液濃度為1×108 CFU/mL。

1. 2. 2 大鯢病原菌接種試驗(yàn) 供試大鯢規(guī)格250～300 g/尾，隨機(jī)分成4組，每組15尾，暫養(yǎng)1周后無任何病變方可用于接種試驗(yàn)。第一組為對(duì)照組，接種PBS（0.5 mL/尾）；第二組接種嗜水氣單胞菌懸液（試驗(yàn)組），接種劑量為0.5 mL/尾。分別在攻毒后12、24、36和48 h從對(duì)照組和試驗(yàn)組中各取3尾大鯢，無菌解剖后取其皮膚和肝臟組織速凍于液氮中，備用。

1. 2. 3 RNA提取及cDNA合成 凍存組織采用Trizol提取總RNA，具體步驟參照Trizol試劑盒說明。提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，并使用核酸蛋白儀（Eppendorf）檢測(cè)總RNA濃度。以反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT Reagent Kit（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄過程中向樣品總RNA加入1.0 μL DNA-Eraser后置于PCR儀中，隨后加入反轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和引物進(jìn)行混合，混合終體積10.0 μL，樣品混勻后在PCR儀（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA反轉(zhuǎn)錄后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 qPCR定量分析 按SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明，在Bio-rad CXF96熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量分析，引物序列詳見表1。qPCR反應(yīng)體系20.0 μL，包括SYBR Green PCR Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s；65 ℃下采集熒光信號(hào)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001；史黎黎等，2016），應(yīng)用SPSS 17.0中的單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以SigmaPlot 13.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 大鯢組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)從大鯢皮膚和肝臟抽提的總RNA質(zhì)量，當(dāng)OD260/OD280在1.8～2.0時(shí)即為合格樣品。以1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果（圖1）顯示，檢測(cè)樣品均清晰可見RNA的2條主帶（28S rRNA和18S rRNA），說明抽提獲得的大鯢組織總RNA分子完整性好，可用于后續(xù)研究。

2. 2 qPCR的擴(kuò)增特異性

通過qPCR定量分析，發(fā)現(xiàn)大鯢抗菌肽家族3個(gè)基因（KK1、KK5和KK8）的擴(kuò)增曲線均出現(xiàn)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期（圖2），表明針對(duì)抗菌肽家族基因KK1、KK5和KK8設(shè)計(jì)的qPCR擴(kuò)增引物特異性強(qiáng)，且擴(kuò)增效果良好，可用于后續(xù)研究。

2. 3 抗菌肽基因KK1在接種嗜水氣單胞菌大鯢組織中的表達(dá)情況

采用qPCR分析抗菌肽家族基因KK1在接種嗜水氣單胞菌大鯢皮膚和肝臟中的響應(yīng)情況，結(jié)果表明，大鯢抗菌肽基因KK1在皮膚和肝臟組織中均有表達(dá)（圖3）。在皮膚組織中，抗菌肽基因KK1的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～36 h較對(duì)照組顯著上調(diào)（P<0.05，下同），尤其在攻毒后24 h的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)16.44倍。在肝臟組織中，除攻毒后24 h的抗菌肽基因KK1相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)5.53倍外，其他攻毒時(shí)間點(diǎn)則表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。

2. 4 抗菌肽基因KK5在接種嗜水氣單胞菌大鯢組織中的表達(dá)情況

qPCR分析結(jié)果表明，大鯢抗菌肽基因KK5在皮膚和肝臟組織中均有表達(dá)（圖4）。在皮膚組織中，抗菌肽基因KK5的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～48 h較對(duì)照組顯著上調(diào)，尤其在攻毒后24 h的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)7.10倍。在肝臟組織中，除攻毒后12 h的抗菌肽基因KK5相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)3.60倍外，其他攻毒時(shí)間點(diǎn)則表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)?？梢?，大鯢皮膚組織中的抗菌肽KK5較肝臟組織中的KK5更積極響應(yīng)嗜水氣單胞菌侵染，但響應(yīng)速度不及肝臟組織中的KK5快。

2. 5 抗菌肽基因KK8在接種嗜水氣單胞菌大鯢組織中的表達(dá)情況

qPCR分析結(jié)果表明，大鯢抗菌肽基因KK8在皮膚和肝臟組織中均有表達(dá)（圖5）。在皮膚組織中，抗菌肽基因KK8的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～48 h較對(duì)照組顯著上調(diào)，其中攻毒后48 h的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的123.08倍。在肝臟組織中，攻毒后24 h的抗菌肽基因KK8相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào)8.45倍，攻毒后36 h的相對(duì)表達(dá)量則顯著下調(diào)，為對(duì)照組的13.37%；其他時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組和對(duì)照組間的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。

2. 6 抗菌肽家族基因不同組織響應(yīng)分析結(jié)果

對(duì)大鯢抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水氣單胞菌侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在大鯢皮膚組織中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～36 h均顯著高于對(duì)照組；而在肝臟組織中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相對(duì)表達(dá)量分別在攻毒后24、12和24 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，其他時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組，說明這3個(gè)抗菌肽基因在早期積極響應(yīng)嗜水氣單胞菌的侵染，但相對(duì)于皮膚組織，其高表達(dá)量持續(xù)時(shí)間較短。由此推測(cè)，在嗜水氣單胞菌侵染大鯢的過程中，皮膚組織抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在其免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著更重要的作用。

3 討論

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體遭受外界病原物侵染時(shí)，機(jī)體會(huì)作出相應(yīng)的免疫應(yīng)答，調(diào)動(dòng)體內(nèi)相關(guān)免疫因子共同抵抗外界病原物的入侵，以恢復(fù)和保證機(jī)體的健康狀態(tài)?？咕脑跈C(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能作用，廣泛分布于動(dòng)物體的各組織器官中，對(duì)多種病原微生物均有抑制作用，有些抗菌肽甚至具有抗寄生蟲、病毒和腫瘤的作用（Bals et al.，1998；黎銘等，2017）?？梢姡咕脑诩膊≈委煹确矫婢哂袕V闊的應(yīng)用前景（王霞，2015）。皮膚暴露外表，是抵御微生物感染的第一線防線（Murakami et al.，2002）。已有研究證實(shí)，兩棲類動(dòng)物的粒狀皮膚腺體能合成并釋放出多種抗菌肽物質(zhì)，提供有效和快速的微生物防御作用（Duda et al.，2002；Xu and Lai，2015）。本研究結(jié)果表明，大鯢皮膚組織中抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相對(duì)表達(dá)量在攻毒后12～36 h均顯著高于對(duì)照組；而在肝臟組織中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相對(duì)表達(dá)量分別在攻毒后24、12和24 h時(shí)顯著高于對(duì)照組，其他時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組。其中，抗菌肽家族基因KK1和KK8在大鯢皮膚響應(yīng)嗜水氣單胞菌的侵染比在肝臟組織中更積極。說明抗菌肽在皮膚中的特異表達(dá)對(duì)啟動(dòng)機(jī)體天然免疫應(yīng)答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

嗜水氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是環(huán)境中常見的細(xì)菌種類之一，可引起人類、畜禽及水生動(dòng)物等感染致病（王霞，2015；覃俊奇等，2018），其感染大鯢主要引發(fā)腹水病、腐皮病、敗血癥或爛腿病等（周小愿等，2012）。本研究通腹腔注射嗜水氣單胞菌感染大鯢，并分別在攻毒后12、24、36和48 h隨機(jī)挑取大鯢進(jìn)行取樣檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因在健康大鯢皮膚和肝臟組織中已有表達(dá)，但經(jīng)腹腔注射嗜水氣單胞菌后抗菌肽基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。同時(shí)，通過對(duì)比大鯢皮膚和肝臟兩種組織中抗菌肽基因的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)皮膚組織在不同時(shí)間點(diǎn)更積極響應(yīng)嗜水氣單胞菌的侵染。注射嗜水氣單胞菌能促使大鯢抗菌肽基因表達(dá)量上調(diào)，說明免疫系統(tǒng)對(duì)外界病原微生物的入侵已作出應(yīng)答，即抗菌肽在大鯢免疫系統(tǒng)抵御外界病原微生物感染的過程中發(fā)揮重要作用。該結(jié)論為揭示抗菌肽在病原菌侵染大鯢機(jī)體的響應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水氣單胞菌侵染大鯢時(shí)積極作出應(yīng)答，尤其在皮膚組織中的特異表達(dá)對(duì)啟動(dòng)機(jī)體天然免疫應(yīng)答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）