酶法提取鮑魚內臟多糖工藝的優(yōu)化

陳勝軍 劉先進 楊賢慶 李來好 黃卉 李春生

摘要：【目的】優(yōu)化鮑魚內臟多糖酶解工藝條件，為鮑魚內臟多糖的提取和高值化利用提供技術支持?！痉椒ā恳噪s交鮑內臟為原料、多糖提取率為評價指標，從6種蛋白酶中篩選出提取鮑魚內臟多糖的適宜酶制劑，并在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對多糖提取率影響較大的蛋白酶作用條件進行優(yōu)化，依據回歸分析確定其最適作用條件?！窘Y果】胰蛋白酶是提取鮑魚內臟多糖的適宜酶制劑；各因素對鮑魚內臟多糖提取率的影響排序為料液比>pH>加酶量，料液比與pH的交互作用對多糖提取率影響顯著（P<0.05），而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用對多糖提取率影響不顯著（P>0.05）。胰蛋白酶提取鮑魚內臟多糖的最適工藝條件為：料液比1∶49（g/mL）、pH 8.6、加酶量2.1%、酶解時間2 h、酶解溫度37 ℃，在此條件下，鮑魚內臟多糖提取率為6.97%，與預測值（6.99%）接近?！窘Y論】通過響應面試驗優(yōu)化的胰蛋白酶酶解工藝可有效提取鮑魚內臟多糖，建立的回歸模型可用于實際生產預測。

關鍵詞： 鮑魚；內臟；酶解法；多糖提取率；響應面分析

中圖分類號： S986.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1389-07

0 引言

【研究意義】多糖、蛋白質與核酸并稱為三大生命物質（蔡孟深和李中軍，2007），其中多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等作用（Zhu et al.，2010a，2010b；Li et al.，2011；鄒文文，2013；Wang et al.，2014），在功能食品和臨床醫(yī)學上被廣泛應用。我國是世界第一養(yǎng)鮑大國，養(yǎng)殖產量從2006年的2.16萬t快速增長至2016年的13.97萬t，近十年來的年均增長率達54.68%（農業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2017）。鮑魚內臟占總體質量的20%左右，有很大的開發(fā)利用空間，但目前我國對鮑魚加工副產物尚未充分利用，不僅造成原材料浪費，還易引起環(huán)境污染。因此，研究鮑魚內臟多糖的提取工藝，對提高鮑魚資源綜合利用率和鮑魚加工產品的附加值具有重要意義。【前人研究進展】在鮑魚多糖的組成和活性功能方面，吳耀文等（2002）對雜色鮑中分離出的一種硫酸酯多糖組成進行研究，結果發(fā)現其主要由半乳糖、葡萄糖和少量木糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸組成；劉春燕（2011）通過試驗發(fā)現鮑魚內臟多糖具有免疫活性；羅曉航（2012）研究發(fā)現鮑魚內臟粗多糖可能具有抗氧化能力。在鮑魚多糖提取方面，殷紅玲等（2006）通過正交試驗對酶法提取鮑魚肉中多糖的工藝進行優(yōu)化，結果表明，木瓜蛋白酶的適宜反應條件為溫度55 ℃、時間2 h、pH 8.0、料液比1∶40、加酶量2.0%，在此條件下多糖提取率為19.60%；余鑫（2012）研究鮑魚內臟粗多糖提取工藝，得到最佳工藝條件為酶解時間2.5 h、料液比1∶6、加酶量2.4×104 U/g、酶解溫度55 ℃；Xu等（2016）通過酶水解、陰陽離子交換樹脂等方法提取出鮑魚內臟多糖，結果表明這些方法均具有可行性，所得內臟多糖純度較高?！颈狙芯壳腥朦c】目前，利用響應面法優(yōu)化鮑魚內臟多糖提取工藝的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化鮑魚內臟酶解工藝，以獲得最適的酶解工藝條件，為鮑魚內臟多糖的提取和高值化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

雜交鮑內臟取自福建連江產雜交鮑，經組織搗碎機搗碎混勻制成樣品，于-20 ℃冷凍保藏。堿性蛋白酶（580000 U/g）和中性蛋白酶（100 U/mg）購自廣州柏棠貿易有限公司，Alcalase蛋白酶（2.4 AU/g）、胃蛋白酶（10000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）和木瓜蛋白酶（800 U/mg）購自廣州齊云生物技術有限公司，鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為國產分析純。主要儀器設備：Sunrise-basic Tacan吸光酶標儀（瑞士Tecan公司）、TDZ5-WS臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、LFP-800T萊芙粉碎機（永康紅太陽機電有限公司）、Alpha 1-4冷凍干燥機（德國Marin Christ公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 鮑魚內臟多糖提取工藝流程 鮑魚內臟→凍干→粉碎過40目篩→鮑魚內臟粉→調節(jié)料液比→調節(jié)pH→酶解預定時間→沸水滅酶10 min→冷卻，調中性→離心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍體積的95%乙醇→醇沉過夜→離心→測多糖提取率。

1. 2. 2 最佳用酶選擇 蛋白酶由于來源及其酶切位點不同，因此對生物的酶解效果有所差異（黃小葳，2011）。利用不同種類的蛋白酶對鮑魚內臟進行酶解，酶解條件見表1，按照1.2.1方法提取分離得到多糖，以多糖提取率為評價指標，選擇最佳蛋白酶。

1. 2. 3 胰蛋白酶的單因素試驗 根據最佳用酶的試驗結果，選用胰蛋白酶作為酶解蛋白酶，準確稱取一定量的鮑魚內臟粉，以料液比、pH、酶解時間、酶解溫度和加酶量為可變因素，采用1.2.1方法提取多糖，并測定多糖含量。

1. 2. 4 鮑魚內臟多糖酶解工藝的響應面優(yōu)化 在單因素試驗的基礎上，通過SPSS 20.0進行方差分析，選擇對多糖提取率有顯著影響的3個因素（料液比、pH和加酶量），根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理（趙志霞等，2017），以多糖提取率為評價指標進行響應面試驗，進一步優(yōu)化鮑魚內臟酶解工藝。響應面因素水平設計如表2所示。

1. 3 多糖含量測定

采用苯酚—硫酸法測定鮑魚內臟多糖含量（程婷婷等，2008）。

多糖提取率（%）=提取物中多糖含量（g）/原料干品質量（g）×100

1. 4 統計分析

采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析，Design Expert 8.0.6對試驗數據進行回歸分析。

2 結果與分析

2. 1 最佳用酶篩選結果

由圖1可知，采用胰蛋白酶酶解鮑魚內臟的多糖提取率最高，可達3.56%，而胃蛋白酶多糖提取率最低，僅有2.09%。影響提取率最重要的因素是酶的種類及提取工藝條件，不同蛋白酶在其底物的酶切位點不同，其具有專一性。由于酶具有專一性即只對某一特定蛋白結構進行酶切，而動物多糖大多與蛋白相連，因此為了提取多糖，必須將蛋白與多糖分離開，故酶的專一性越差多糖提取率就越高。從試驗結果來看，選擇胰蛋白酶為最佳水解酶進行后續(xù)試驗。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 料液比對鮑魚內臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、pH 8.0、酶解時間3 h、加酶量2.0%的條件下，考察料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）對酶法提取鮑魚內臟多糖效果的影響。由圖2可看出，料液比從1∶20到1∶50遞變時，鮑魚內臟多糖提取率逐漸增加，在1∶50時達最大值（6.46%），料液比從1∶50到1∶60遞變時，多糖提取率逐漸降低。料液比1∶40、1∶50和1∶60間的多糖提取率無顯著差異（P>0.05，下同），但與1∶20存在顯著差異（P<0.05，下同）。料液比太大或太小均會對多糖提取造成負面影響，比值太大時，體系黏度過大，流動性較差，不利于底物與酶的充分反應，從而對酶促反應產生一定的抑制作用；比值太小時，底物濃度和酶濃度都會被稀釋，造成酶與底物接觸的幾率降低，也不利于多糖提?。ɡ铎o等，2014）。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚內臟多糖的適宜料液比為1∶50。

2. 2. 2 pH對鮑魚內臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、料液比1∶40、酶解時間3 h、加酶量2.0%的條件下，考察pH（7.0、7.5、8.0、8.5和9.0）對酶法提取鮑魚內臟多糖效果的影響。由圖3可看出，pH從7.0到8.5遞變時，多糖提取率逐漸增加，pH 8.5時達最大值（6.94%），pH從8.5到9.0遞變時，多糖提取率逐漸降低。pH在8.0、8.5和9.0時，多糖提取率間無顯著差異，但三者與pH 7.0和7.5的多糖提取率存在顯著差異。在酶催化過程中，pH通過影響酶活性，從而影響酶的催化速率（程婷婷等，2008）。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚內臟多糖的最適pH為8.5。

2. 2. 3 酶解時間對鮑魚內臟多糖提取率的影響 在酶解溫度37 ℃、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的條件下，考察酶解時間（1、2、3、4和5 h）對酶法提取鮑魚內臟多糖效果的影響。由圖4可看出，酶解時間1～5 h的多糖提取率間無顯著差異；酶解時間由1 h延長至2 h時，多糖提取率逐漸增加，酶解2 h后多糖提取率反而下降?？赡苁怯捎诿附夥磻? h時多糖已最大程度溶出，隨著酶解時間的延長，某些小分子量的多糖附著在大分子蛋白上，在醇沉過程中被除去，同時，酶解時間過長，酶解液易變質，導致多糖提取率下降。因此，確定2 h是最佳酶解時間。

2. 2. 4 酶解溫度對鮑魚內臟多糖提取率的影響 在酶解時間3 h、料液比1∶40、pH 8.0、加酶量2.0%的條件下，考察酶解溫度（27、32、37、42和47 ℃）對酶法提取鮑魚內臟多糖效果的影響。由圖5可看出，酶解溫度為27～47 ℃的多糖提取率間無顯著差異；酶解溫度由27 ℃升至37 ℃時，多糖提取率逐漸增加，在37 ℃時達最大值（6.76%），酶解溫度從37 ℃升至47 ℃時，多糖提取率逐漸降低。隨著酶解溫度的逐漸升高，酶活力增強，但超過蛋白酶的最適溫度后，酶蛋白變性效應會抵消其反應速率，從而使酶活力減弱，提取率降低。因此，胰蛋白酶酶解的最適溫度為37 ℃。

2. 2. 5 加酶量對鮑魚內臟多糖提取率的影響 在酶解時間3 h、料液比1∶40、pH 8.0、酶解溫度37 ℃的條件下，考察加酶量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）對酶法提取鮑魚內臟多糖效果的影響。由圖6可看出，加酶量在1.0%～2.0%范圍內，多糖提取率逐漸增加，2.0%時達最大值（6.73%），加酶量在2.0%～3.0%范圍內，多糖提取率逐漸降低。加酶量從1.5%增加至3.0%的多糖提取率間無顯著差異，但2.0%加酶量與1.0%加酶量存在顯著差異。在酶與底物飽和之前，加酶量越大，反應越充分，多糖提取率越高；當加酶量飽和后，蛋白與酶完全結合，若繼續(xù)添加酶制劑，不僅無法提高酶解效果，還會增加蛋白雜質含量，同時一些小分子多糖會隨著醇沉被除去，導致多糖提取率下降。綜合考慮，胰蛋白酶提取鮑魚多糖的最適加酶量為2.0%。

2. 3 響應面結果分析

2. 3. 1 響應面試驗結果 利用SPSS 20.0對胰蛋白酶的單因素試驗進行顯著性分析，從圖2～圖6可發(fā)現，酶解時間和酶解溫度對鮑魚內臟多糖提取率無顯著影響，而料液比、pH和加酶量對多糖提取率有顯著影響。因此，選取料液比（A）、pH（B）和加酶量（C）3個因素為自變量，以多糖提取率（Y）為考察指標進行響應面試驗，結果見表3。

2. 3. 2 回歸方程及參數分析 通過Design Expert 8.0.6對表3的試驗結果進行擬合分析，得到二次回歸方程Y=6.980-0.066A+0.056B+0.038C+0.110AB-（2.500E-0.030）AC+0.052BC-0.230A2-0.180B2-0.230

C2。

對回歸方程進行方差分析，結果（表4）表明，該回歸模型P=0.0011<0.01，表明二次方程擬合極顯著，失擬項P=0.6159>0.05不顯著，表明該模型準確。R2=0.9468，表明方程能很好地代表各因素與多糖提取率之間的關系（王姣等，2015），可通過方程確定胰蛋白酶酶解鮑魚內臟多糖的最佳工藝。根據F大小，各因素對鮑魚內臟多糖提取率的影響順序為A>B>C。根據P變化可知，A2、B2和C2對多糖提取率影響極顯著（P<0.01），AB對多糖提取率影響顯著，A、B和C不顯著，與單因素試驗結果相一致。

2. 3. 3 響應面交互作用分析 采用Design Expert 8.0.6對表3數據進行擬合分析，繪制等高線和響應面（圖7）。從擬合的響應面圖可直觀看出各因素間的交互作用，曲面圖的陡峭程度代表各因素對多糖提取率的影響程度。響應面坡度越陡，說明該因素影響較大。從圖7可看出，AB響應面坡度較陡，而BC、AC響應面坡度較平緩，說明料液比與pH的交互作用對鮑魚內臟多糖提取率影響顯著，而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用對多糖提取率影響不顯著；料液比響應面的陡峭程度大于pH和加酶量，pH響應面的陡峭程度大于加酶量，說明料液比對多糖提取率的影響大于pH和加酶量，pH對多糖提取率的影響大于加酶量，與表4的方差分析結果相符合。

2. 3. 4 工藝優(yōu)化及模型驗證 采用Design Expert 8.0.6進行分析處理，得到胰蛋白酶酶解鮑魚內臟多糖的最優(yōu)條件為：料液比1∶48.9、pH 8.57、加酶量2.05%，在此條件下鮑魚內臟多糖提取率為6.99%。為檢驗模型預測的準確性，并考慮實際操作，將工藝參數優(yōu)化為料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%，以此條件進行重復試驗，得到多糖提取率為6.97%，與預測值接近，表明建立的模型可用于預測實際值。

3 討論

多糖的提取方法通常有熱水浸提法、酸堿提取法、酶法提取和儀器輔助提取法等。由于熱水浸提法提取率低，酸堿提取法具有局限性，會破壞多糖活性，因此現階段主要采用酶法提取和儀器輔助提取法。程婷婷等（2008）通過單因素和正交試驗得到堿性蛋白酶提取鮑魚內臟多糖的最佳提取工藝：酶解溫度45 ℃、料液比1∶45、pH 10、加酶量2%、酶解時間3 h，在此條件下多糖提取率為6.5%；羅曉航等（2012）利用儀器輔助提取法，將樣品用高壓脈沖電場進行前處理，通過正交試驗優(yōu)化鮑魚內臟多糖提取工藝條件，多糖含量可達21.73%。本研究以雜交鮑內臟為原料，通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶6種酶提取鮑魚內臟多糖，以多糖提取率為考察指標，最終得出胰蛋白酶的鮑魚內臟多糖提取率最高。這是由于不同種類蛋白酶的酶切位點不同，可能鮑魚內臟糖蛋白的胰蛋白酶酶切位點較多，使其內臟多糖可更多的被切除出來，從而提高多糖提取率。因此確定胰蛋白酶作為提取鮑魚內臟多糖的適宜酶制劑。通過響應面法優(yōu)化多糖提取條件，在料液比1∶49、pH 8.6、加酶量2.1%的條件下得到鮑魚內臟多糖提取率為6.97%，較酶篩選時的3.56%高，是由于篩選試驗只是針對酶的最適環(huán)境，而提取過程是酶與底物的共同作用，因此其最適條件有所不同；響應面優(yōu)化的工藝條件即為酶與底物的最佳工藝條件，因此其提取率會增加。本研究獲得的鮑魚內臟多糖提取率與程婷婷等（2008）獲得的多糖提取率6.5%相近，可能由于均采用酶法提?。幌啾扔诹_曉航等（2012）的儀器輔助提取法，單一酶提取法的多糖提取率較低，下一步可將儀器輔助與復合酶法相結合進行多糖提取工藝研究，如微波輔助復合酶法等。

殷紅玲等（2006）通過正交試驗得到木瓜蛋白酶提取鮑魚肉中多糖的最佳提取工藝條件，但由于正交的局限性并不能得到理論的最優(yōu)值。響應面可反映出因素間的交互作用并找出最優(yōu)點（何念武等，2016），本研究通過響應面分析，得到單因素及兩兩因素間交互作用對鮑魚內臟多糖提取率的影響，其中料液比與pH的交互作用影響顯著，而料液比與加酶量、pH與加酶量的交互作用影響不顯著；料液比對多糖提取率的影響大于pH和加酶量，pH對多糖提取率的影響大于加酶量。

4 結論

通過響應面試驗優(yōu)化的胰蛋白酶酶解工藝可有效提取鮑魚內臟多糖，建立的回歸模型可用于實際生產預測。

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（責任編輯 羅 麗）