芍藥苷和芍藥內酯苷的抗抑郁作用與NO/cGMP信號轉導通路的相關性

吳麗 王麗麗 李偉 侯燕 王景霞 張建軍

摘要目的：比較赤芍、白芍及其有效成分芍藥苷、芍藥內酯苷對小鼠的抗抑郁作用及其與NO/cGMP信號轉導通路的相關性。方法：選取小鼠懸尾實驗模型，給予赤芍水提物、白芍水提物，記錄小鼠懸尾不動時間。采用相同實驗方法給予小鼠芍藥苷和芍藥內酯苷，并檢測小鼠大腦皮質及海馬組織中NO/cGMP通路相關指標。結果：與模型組比較，2 g/kg赤芍和2 g/kg、1 g/kg白芍組小鼠懸尾不動時間減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與2 g/kg赤芍同劑量組比較，白芍的小鼠懸尾不動時間減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與模型組比較，20 mg/kg芍藥苷組、20 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠懸尾不動時間及NO、cGMP含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；且與10 mg/kg芍藥苷同劑量組比較，芍藥內酯苷組的小鼠懸尾不動時間及NO含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與模型組比較，20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠nNOS、GluR1mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。結論：白芍具有抗抑郁作用，芍藥苷和芍藥內酯苷是白芍抗抑郁作用的物質基礎；與白芍比較，赤芍的抗抑郁作用較弱，與其主要含有抗抑郁作用較弱的芍藥苷，而不含抗抑郁作用較強的芍藥內酯苷有關。

關鍵詞赤芍；白芍；芍藥苷；芍藥內酯苷；懸尾實驗；抗抑郁；NO；cGMP

Correlation Study on Antidepressant Effect of Paeoniflorin and Albiflorin and NO/cGMP Signal Transduction Pathway

Wu Li1， Wang Lili2， Li Wei1， Hou Yan1， Wang Jingxia1， Zhang Jianjun1

（1 College of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2 Department of Pharmacy， Beijing Jingmei Group General Hospital， Beijing 102300， China）

AbstractObjective：To investigate the correlation between antidepressant effects of paeoniflorin and albiflorin on mice and NO/cGMP signal transduction pathway. Methods：Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba was intragastric administered to the mice to establish the mice model of antidepressant with tail suspension test （TST）， and the time of immobility was recorded. The same methods were used to study paeoniflorin and albiflorin. And the NO/cGMP pathway related indicators of cerebral cortex and hippocampus were detected. Results：Compared with model group， 2 g/kg Radix Paeoniae Rubra and 2 g/kg， 1 g/kg Radix Paeoniae Alba can reduce the immobility time of tail suspension （P<005， P<0001， P<005）. Compared with the same dose of Radix Paeoniae Rubra， the TST immobility time of 2 g/kg Radix Paeoniae Alba were obviously lower （P<005）. Compared with model group， 20 mg/kg paeoniflorin， 20 mg/kg albiflorin can reduce the immobility time of tail suspension and the content of NO， cGMP （P<005， P<0001）； Compared with the same dose of paeoniflorin， the immobility time of tail suspension and the content of NO of 10 mg/kg albiflorin were obviously lower （P<005）. Compared with model group， 20 mg/kg paeoniflorin and 20 mg/kg albiflorin can reduce the mRNA expression of nNOS， GluR1 （P<005， P<001， P<005）. Conclusion：Radix Paeoniae Alba has antidepressant effect， and paeoniflorin and albiflorin are the material basis of the antidepressant effect of Radix Paeoniae Alba； however， in the administration range of this experiment， the antidepressant effect of Radix Paeoniae Rubra is not obvious compared with that of Radix Paeoniae Alba， which may be related with it mainly containing paeoniflorin which antidepressant effect is weaker， but not containing albiflorin which antidepressant effect is stronger.

Key WordsRadix Paeoniae Rubra； Radix Paeoniae Alba； Paeoniflorin； Albiflorin； Tail suspension test； Antidepressant； NO； cGMP

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.038

芍藥首載于《神農本草經》，列為中品藥；直至梁朝陶弘景《本草經集注》將其區(qū)分為赤芍、白芍2種。研究表明，兩者及兩者主要成分白芍總苷、赤芍總苷均具有抗抑郁作用[12]。抑郁癥屬中醫(yī)“郁證”“虛勞”范疇，其發(fā)病多始于肝，及于心神，并與腦相關[34]。赤芍、白芍均歸肝經，治療肝郁脅痛等病癥[5]，廣泛用于郁癥等疾病的防治之中[1]。赤芍、白芍主要化學成分均為單萜類化合物，芍藥苷為兩者共有成分，而芍藥內酯苷為白芍的特征性成分[6]；且兩者均具有抗抑郁作用[78]。我們采用小鼠懸尾實驗模型，給予赤芍水提物、白芍水提物、芍藥苷、芍藥內酯苷，記錄小鼠懸尾不動時間，并檢測大腦皮質及海馬組織中NO/cGMP通路相關指標，研究赤芍、白芍以及芍藥苷、芍藥內酯苷的抗抑郁作用及作用機制。

1材料與方法

11材料

111動物SPF級昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，由維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證編號：SCXK（京）20150001。

112藥物1）受試藥物：赤芍水提物、白芍水提物、芍藥苷、芍藥內酯苷。赤芍飲片購自內蒙古，白芍飲片購自安徽亳州。經北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院科研實驗中心鑒定合格，并由北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院中藥學實驗室制備。赤芍水提物按常規(guī)方法制備，計算出膏率為375%，經高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定，含芍藥苷為826%，芍藥內酯苷為0。白芍水提物按常規(guī)方法制備，計算出膏率為275%；經HPLC測定，含芍藥苷為772%，芍藥內酯苷為43%。2）芍藥苷和芍藥內酯苷：按專利技術方法自制，純度均高于96%。3）陽性藥：鹽酸氟西汀膠囊，南京新百藥業(yè)有限公司，批號1503031。

113試劑與儀器一氧化氮測試盒，環(huán)磷酸鳥苷放免試劑盒，購自北京華英生物技術研究所。Trizol試劑（RNA提取劑），購自Invitrogen公司。MMLV逆轉錄酶，購自Promega公司。SYBER Green I實時熒光定量PCR試劑盒，購自Roche公司。所測指標相應引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。鐵架臺，剪刀，膠布，JZ型100 g張力換能器（高碑店市新航機電設備有限公司）；Medlab生物信號采集系統(tǒng)（南京易美科技有限公司）；Medlab生物軟件。日本日立7160全自動生化儀，r911全自動放免計數儀，LightCycler 20實時熒光定量PCR儀（Roche診斷公司）。

12方法

121分組與模型制備取正常小鼠70只，按體重隨機均分成7組，即空白組，模型組，鹽酸氟西汀組，2 g/kg、1 g/kg赤芍水提物組，2 g/kg、1 g/kg白芍水提物組，適應性飼養(yǎng)5 d（室溫20～22 ℃，相對濕度65%～70%，12 h為晝夜周期環(huán)境，自由飲食進水）。

122給藥方法

各給藥組均灌胃給予相應藥物，按每10 g體重灌胃02 mL給藥，1次/d?？瞻捉M和模型組給予等劑量蒸餾水，鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀溶液35 mg/kg。

實驗動物分組同上。給藥方法為腹腔注射給藥，注射劑量01 mL/10 g，其中芍藥苷組的劑量分別為20 mg/kg、10 mg/kg，芍藥內酯苷組的劑量分別為20 mg/kg、10 mg/kg。

123檢測指標與方法以上各組均連續(xù)給藥3 d，末次給藥后1 h，除空白組外，將其余小鼠尾端（距離尾尖約2 cm處）用膠布固定在100 g張力換能器的連線上，使其呈倒懸狀態(tài)，其頭部距離實驗臺約15 cm，每次測試2只小鼠，且相互之間用紙板隔開。換能器連接至Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)，適應2 min后，記錄4 min之內不動狀態(tài)，并將其換算成小鼠懸尾不動時間（s）。芍藥苷和芍藥內酯苷對小鼠懸尾實驗的影響的小鼠在記錄小鼠懸尾不動時間后，脫頸椎處死，剝離大腦，取大腦皮質和海馬，置于凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

采用格里斯法，按照NO試劑盒說明測定小鼠大腦皮質中NO含量；采用放射免疫法，按cGMP試劑盒說明測定各組小鼠大腦皮質中cGMP含量。

取各組小鼠海馬組織100 mg，在研磨器中研磨裂解，并離心。海馬組織總RNA的提取按照Trizol試劑盒說明進行，并經紫外分光光度計檢測樣本RNA含量和純度。根據總RNA逆轉錄合成cDNA。釆用SYBR Green I熒光染料技術，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應條件為94 ℃ 10 min、94 ℃ 10 s、X ℃（基因相應退火溫度）10 s、72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳確認擴增產物是否符合原設計片段長度。采用Light Cycler系統(tǒng)進行PCR反應及數據采集。實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（RTqPCR）測定小鼠海馬組織nNOS、sGCα2、GluR1mRNA基因表達水平。引物設計見表1。

13統(tǒng)計學方法采用SPSS 200統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析，數據結果以均值±標準差（±s）表示。先對數據進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，數據符合正態(tài)分布，方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

21赤芍、白芍對小鼠懸尾不動時間的影響與模型組比較，氟西汀組的小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；2 g/kg赤芍水提物組和2 g/kg白芍水提物組小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；1 g/kg白芍水提物組小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與2 g/kg赤芍同劑量組比較，白芍水提物組的小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。見表2。

22芍藥苷、芍藥內酯苷對小鼠懸尾不動時間及NO/cGMP的影響與模型組比較，氟西汀組、20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg、10 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；且與10 mg/kg芍藥苷同劑量組比較，芍藥內酯苷組的小鼠懸尾不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與模型組比較，空白組、氟西汀組、20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg、10 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠NO含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；且與10 mg/kg芍藥苷同劑量組比較，芍藥內酯苷組的NO含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。與模型組比較，空白組、氟西汀組、20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠cGMP含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。見表3。

23芍藥苷、芍藥內酯苷對小鼠nNOS、sGCα2、GluR1mRNA表達的影響與模型組比較，空白組nNOS、GluR1mRNA表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；氟西汀組、20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg、10 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠nNOSmRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；氟西汀組、20 mg/kg芍藥苷組及20 mg/kg芍藥內酯苷組的小鼠GluR1mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。見表4。

3討論

抑郁癥是一種以顯著持久的情緒低落、悲觀自責為主要特征的常見精神障礙，嚴重者可出現自殺念頭和行為，且具有高發(fā)病、高復發(fā)、高醫(yī)療成本的特點。目前臨床上抗抑郁藥的療效雖值得肯定，但普遍存在藥效弱、起效慢、作用時間短、不良反應明顯等弊??；而就抑郁癥狀的復雜多變、患者的依從性及藥物的不良反應而言，中醫(yī)藥對于抑郁癥的治療顯示出獨特的優(yōu)勢，且逐漸成為研究的熱點[910]。

中醫(yī)雖無抑郁癥這一病名，根據其發(fā)病特點多將其歸屬于郁證、虛勞等范疇。結合藥理實驗研究與臨床應用，白芍和赤芍均可用于治療抑郁癥[1]。

白芍歸肝、脾經，具有養(yǎng)血柔肝、斂陰止汗之功效，與柴胡配伍疏肝解郁、調暢情志組成四逆散、逍遙丸等臨床常用抗抑郁方劑。赤芍歸肝經，清熱涼血、化瘀止痛，有研究表明其與淫羊藿、石菖蒲組成藥對具有良好的抗抑郁作用[1112]。

本實驗采用行為絕望模型中的小鼠懸尾模型進行研究，懸尾小鼠為克服不正常體位首先產生以逃避為導向的掙扎運動，在經過努力仍不能擺脫后而出現間歇性不動，出現“行為絕望”，產生與人類抑郁癥相似的生理生化狀態(tài)[13]。氟西汀是臨床常用治療抑郁癥等精神疾患的藥物，前期研究表明，35 mg/kg鹽酸氟西汀在小鼠懸尾模型中抗抑郁作用明顯[7]。1 g/kg的赤芍與白芍給藥劑量相當于成人每日臨床用量的6 g，并根據兩者芍藥苷、芍藥內酯苷的含量，結合預實驗結果確定芍藥苷、芍藥內酯苷的劑量。實驗結果顯示，白芍具有抗抑郁作用，芍藥苷和芍藥內酯苷是白芍抗抑郁作用的物質基礎；但是，在本實驗給藥范圍內，與白芍比較，赤芍的抗抑郁作用較弱，與其主要含有抗抑郁作用較弱的芍藥苷，而不含抗抑郁作用較強的芍藥內酯苷有關。

NO/cGMP通路為近年來備受關注的抑郁癥發(fā)病機制之一[1415]，NO為新發(fā)現神經系統(tǒng)重要的神經遞質，一方面可直接作用于神經元參與信息傳遞，另一方面可通過催化生成cGMP，作為第二信使發(fā)揮生物效應，參與多種生物功能的調控。過量的NO則可引起神經毒性，通過增加cGMP的合成而在抑郁狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[16]。應激狀態(tài)下，谷氨酸（Glu）與其受體（GluR）結合，引起細胞膜的去極化和Ca2+的內流，從而激活一氧化氮合酶（NOS）催化NO的生成，NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC），從而使cGMP的合成增加[17]。本實驗研究表明，芍藥苷、芍藥內酯苷的可通過降低懸尾小鼠大腦皮質中NO、cGMP水平，降低神經毒性，減少神經元的萎縮及壞死，從而達到抗抑郁作用；進一步研究表明，芍藥苷、芍藥內酯苷可通過降低nNOS、GluR1mRNA的表達而下調NO/cGMP通路。

本研究對比研究了赤芍、白芍及其有效成分芍藥苷、芍藥內酯苷對小鼠懸尾模型的抗抑郁作用，發(fā)現赤芍、白芍及芍藥苷、芍藥內酯苷均具有抗抑郁作用，且治療作用的強弱與劑量呈一定的量效關系，芍藥內酯苷對該模型的抗抑郁作用優(yōu)于芍藥苷。故推測芍藥苷是赤芍與白芍抗抑郁作用的共同有效成分，而芍藥內酯苷是白芍抗抑郁作用優(yōu)于赤芍的物質基礎之一，可作為白芍在抗抑郁作用上區(qū)別于赤芍的特征性有效成分；芍藥苷和芍藥內酯苷抗抑郁作用的機制可能與其下調NO/cGMP通路有關。

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（2017-08-15收稿責任編輯：芮莉莉）