叢子文　鐘步飛　黃東益　謝俊　吳文嬙　許云　夏薇　張榮萍　黃小龍

摘要：[目的]明確我國南方淮山炭疽病病原菌種類及其致病力分化狀況，為淮山炭疽病的綜合防治和抗病育種提供理論依據(jù)。[方法]采用形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合rDNA-ITS序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，對從我國南方6?。▍^(qū)）四川、貴州、云南、廣西、福建和海南淮山種植區(qū)典型炭疽病病葉分離獲得的45株炭疽病病原菌進(jìn)行鑒定，并通過接種在4種不同淮山種質(zhì)（D06-3、D06、D0108和D021）葉片上進(jìn)行致病力檢測，分析不同來源菌株的致病力差異。[結(jié)果]45株炭疽菌均鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。45株炭疽菌對4種淮山種質(zhì)材料均能致病，根據(jù)綜合致病力可將45株炭疽菌分為強(qiáng)、中、弱3種致病類型。其中，6株強(qiáng)致病性菌株均來自廣西，7株弱致病性菌株主要來自云南，32株中等致病力菌株主要來自貴州、福建和海南。[結(jié)論]來源于我國南方6?。▍^(qū)）的45株淮山炭疽病病原菌均為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），其致病力分化明顯，且與地理來源具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：淮山；膠孢炭疽菌；致病力；rDNA-ITS序列分析

中圖分類號：S435.39；S432.44 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）03-0501-07

0引言

[研究意義]淮山（Dfoscorea opposita Thunb.）又稱山藥，是薯蕷科薯蕷屬一年生纏繞性藤本植物，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，是一種藥食兼用的高效經(jīng)濟(jì)作物（黃東益和黃小龍，2013；覃維治等，2014；湯潔等，2016），在歷代本草及地方志中多有記載，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，將其列為上品。炭疽病是對淮山生長危害最嚴(yán)重的病害之一，不僅感染淮山莖、葉和花，還能使零余子和薯塊致病，嚴(yán)重影響淮山薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約了淮山產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（熊軍等，2016；鄭雅超等，2016）。因此，明確炭疽病菌的種類及其致病力分化情況，并據(jù)以采取針對性的防治措施，對保障淮山產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]國內(nèi)外有關(guān)淮山炭疽病的研究主要集中在病原菌的分離、鑒定及防治藥劑篩選等方面。朱桂寧等（2007）采用形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合rDNA-ITS序列分析，將從廣西5個(gè)淮山病區(qū)分離獲得的炭疽病菌鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioi—des）。陳吉良（2011）通過rDNA-ITS序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)海南不同淮山種植區(qū)發(fā)生的淮山炭疽病病原菌均為膠孢炭疽菌，同時(shí)評價(jià)了11種常見化學(xué)農(nóng)藥對膠孢炭疽菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)7種農(nóng)藥對炭疽病病原菌具有一定的抑菌能力，其中多菌靈的抑菌效果最佳。陳富英（2013）評價(jià)了4種殺菌劑田問防治淮山炭疽病的藥效，結(jié)果表明，10%苯醚甲環(huán)唑的防治效果最佳。覃維治等（2015）研究了6種藥劑對廣西桂南地區(qū)淮山藥炭疽病的田間防效，發(fā)現(xiàn)32.5%阿米妙收殺菌劑對淮山藥炭疽病的防治效果最佳。[本研究切入點(diǎn)]前人對淮山炭疽病病原菌鑒定的采樣點(diǎn)僅局限于同一個(gè)省（區(qū)），而我國南方不同?。▍^(qū)）淮山的主栽品種不同，栽培條件各異，淮山炭疽病菌的種類和致病力是否存在差異目前仍不得而知，相關(guān)研究尚無報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]對來源于我國四川、云南、貴州、廣西、福建和海南南方6?。▍^(qū)）的淮山炭疽病病原菌進(jìn)行分離、純化，采用形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合rDNA-ITS序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析對不同來源地炭疽病菌進(jìn)行鑒定，通過接種于不同淮山種質(zhì)檢測各炭疽病菌的致病性，以明確不同?。▍^(qū)）淮山炭疽病菌的種類、遺傳多樣性及致病力分化特征，為淮山抗病種質(zhì)篩選、抗病育種和病害防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株：熱帶作物新品種選育教育部工程研究中心前期分別從四川、貴州、云南、廣西、福建和海南等地采集淮山炭疽病植株病樣，經(jīng)分離培養(yǎng)、純化獲得45株菌株。供試淮山品系：D06—3、D06、D0108和D02 1，來源于海南大學(xué)薯蕷種質(zhì)資源圃。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試菌株形態(tài)觀察和致病性測定 將45株供試菌株接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）上，28℃培養(yǎng)7-10 d，期間進(jìn)行菌株日生長速度測定，觀察病原菌菌落形態(tài)特征，記錄菌落培養(yǎng)性狀。

在供試4份淮山種質(zhì)的生長旺盛期，采摘相同部位、大小一致的健康葉片，無菌水沖洗后，用75%酒精浸泡2 min，無菌水沖洗3～4次，用無菌吸水紙移去多余水分，再用打孔器挑取直徑6 mm的菌餅接種于健康葉片上，28℃恒溫保濕培養(yǎng)，對照用無菌PDA培養(yǎng)基接種，3次重復(fù)。接種7 d后檢查病情，統(tǒng)計(jì)感病情況。

1.2.2淮山炭疽病病情分級及致病力分化測定 淮山炭疽病病情分級參照黃東益和黃小龍（2013）的分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，接種葉片無侵染點(diǎn)，無病斑；1級，接種葉片病斑面積之和<1/8葉片總面積；2級，1/8葉片總面積≤接種葉片病斑面積之和<1/4葉片總面積；3級，1/4葉片總面積≤接種葉片病斑面積之和<1/2葉片總面積；4級，接種葉片病斑面積之和≥1/2葉片總面積?；瓷椒N質(zhì)對炭疽病抗病性分為5級，分級標(biāo)準(zhǔn)（王智，2004）：1級，高感（HS），病情指數(shù)≥55.00；2級，中感（MS），40.00～病情指數(shù)<55.00；3級，中抗（MR），25.00≤病情指數(shù)<40.00；4級，高抗（HR），15.00≤病情指數(shù)<25.00；5級，免疫（I），0≤病情指數(shù)<15.00。菌株致病性類型劃分標(biāo)準(zhǔn)（李越等，2008）：強(qiáng)致病類型（A），平均病情指數(shù)40.00～100.00；中致病類型（B），平均病情指數(shù)20.00-40.10；弱致病類型（c），平均病指數(shù)0.10-20.10；無致病類型（D）：平均病情指數(shù)為0。

病情指數(shù)=∑發(fā)病級別×相應(yīng)發(fā)病級別葉數(shù)×100/（5×調(diào)查總?cè)~數(shù)）

1.2.3淮山炭疽病菌rDNA-ITS序列分析 參考易潤華等（2003）的方法，采用CTAB法提取病原菌總DNA進(jìn)行rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增與序列分析，擴(kuò)增所用引物為ITS序列通用引物ITSl（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）。PCR反應(yīng)體系25.0 LLL：10xPCR緩沖液2.5μL、2.5 mmol/LdNTP 2.0μL、2.5 u/μL TaqDNA聚合酶0.5μL、10μmol/LITS1和ITS4引物各1.0μL、DNA模板2.0μL，ddH20補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 mill；94℃1 min，55℃1min，72℃1.5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增完成后，將45株菌株P(guān)CR產(chǎn)物送至北京華大基因公司測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST比對分析，運(yùn)用Bioedit和MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1淮山炭疽病菌的形態(tài)學(xué)特征

45株炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，不同來源的病原菌培養(yǎng)特征存在差異（表1）。45株菌株的菌落日生長量為5～16 mm；主要產(chǎn)生灰色色素和黑色色素，占比分別為49%和40%，褐色色素和粉色色素較少，占比分別為9%和2%；菌絲有長和短兩種形態(tài)；菌落邊緣灰白色、灰黑色、灰色或褐色；菌落中部隆起或無；菌落有或無輪紋。根據(jù)病原菌上述形態(tài)特征，對照陸家云（2001）、韓長志（2012）的描述，發(fā)現(xiàn)45株菌株與膠孢炭疽菌（C. gloeosporioi-des）的培養(yǎng)特征相似。

2.2淮山炭疽病菌的rDNA-ITS序列分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增獲得的45株炭疽病菌rDNA-ITS序列片段均在500～750 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，供試的45株炭疽病菌菌株均與膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）具有較高的相似性，同源性在96%～100%，片段大小為520～590 bp。

從構(gòu)建的炭疽病菌菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）可知，45株菌株分別與已報(bào)道的膠孢炭疽菌聚在一起，但彼此的親緣關(guān)系存在明顯差異?？傮w上45株炭疽菌可分為兩大分支，即來自福建的菌株DoA84單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支，其他44株菌構(gòu)成另一個(gè)大的分支，其中，來自海南的4株菌DoAl00、DoAl01、DoAl02和DoAl03聚在同一分支上，而其他?。▍^(qū)）來源的菌株相對分散地聚在不同的分支上，說明海南來源的炭疽病菌株在系統(tǒng)進(jìn)化上具有一定的地域性，其他?。▍^(qū)）的炭疽病菌株地域性不強(qiáng)，相互問存在一定交叉。

2.3淮山炭疽病菌的致病力分化情況

45株炭疽菌對4種淮山種質(zhì)材料D06-3、D06、D0108和D021均能致病，不存在專化性現(xiàn)象（表2）；各菌株對4種不同淮山種質(zhì)材料的致病力不同，有致病力分化現(xiàn)象。45株菌株對淮山種質(zhì)材料D06-3、D06、D021和D0108的致病力依次減弱，其中，D06-3和D06表現(xiàn)為中感（Ms），平均病情指數(shù)分別為44.72和39.51；D021表現(xiàn)為中抗（MR），平均病情指數(shù)為32.25；D0108表現(xiàn)為高抗（HR），平均病情指數(shù)為23.26。45株菌株根據(jù)致病力分化可歸為3類，即強(qiáng)致病性菌、中致病性菌和弱致病性菌，其中，強(qiáng)致病性菌共6株，平均病情指數(shù)在40.76～63.15，分別為DoA50、DoA52、DoA53、DoA61、DoA63和DoA64，均來自廣西；中致病性菌共32株，平均病情指數(shù)在31.83-40.10，其中4株來自云南、8株來自貴州、14株來自福建、2株來自廣西、4株來自海南；弱致病力菌7株，平均病情指數(shù)在19.70-19.88，包括來自四川的DoAl、DoA3和來自云南的DoA38、DoA39、DoA40、DoA43、DoA44。

45株炭疽病菌菌株的致病力差異變化存在一定規(guī)律性（表3）。來自四川的2株菌株均為弱致病性菌；來自貴州的8株菌株均為中致病性菌；來自云南的9株菌株中，5株為弱致病性菌，4株為中致病性菌，分別占該地區(qū)分離菌株數(shù)的55.56%和44.44%；來自廣西的8株菌株中，6株為強(qiáng)致病性菌，2株為中致病性菌，分別占75.00%和25.00%；來自福建和海南的18株菌株均為中致病性菌。上述差異顯示，在南方6?。▍^(qū)）淮山炭疽菌的強(qiáng)致病性菌主要來自廣西，弱致病性菌主要來自云南和四川，中致病性菌主要來自貴州、福建和海南，菌株致病力分化與地理來源有一定關(guān)系。

3討論

本研究采用形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析對分離自我國南方6?。▍^(qū)）的淮山炭疽病病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離獲得的45株淮山炭疽病菌均為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioide），與朱桂寧等（2007）、陳吉良（2011）的報(bào)道一致，說明膠孢炭疽菌是我國南方淮山炭疽病的主要病原菌，該病菌在寄主上無特異性，在地理上亦無?；?。45株膠孢炭疽菌菌株問在菌落顏色、菌落形態(tài)及日平均生長量等方面呈現(xiàn)出多樣性變化，與陳希芹（2003）有關(guān)膠孢炭疽菌菌株問形態(tài)特征上的觀察結(jié)果相似。rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析證實(shí)45株膠孢炭疽菌種內(nèi)在親緣進(jìn)化關(guān)系上存在一定的遺傳變異，但這種遺傳變異性與菌株的形態(tài)差異及地理來源均無明顯的相關(guān)性。

目前，許多研究證實(shí)植物病原菌與寄主在共同進(jìn)化的過程中其致病力也隨之不斷變化，同時(shí)出現(xiàn)致病力分化現(xiàn)象，如大麥條紋病菌（司二靜等，2015）、芝麻青枯雷爾氏菌（李信申等，2016）、小麥蠕孢根腐病菌（張眉等，2016）、杧果炭疽病菌（李江華等，2017）、黃瓜褐斑病菌（吳橋等，2017）和水稻紋枯病菌（張優(yōu)等，2017）等，而關(guān)于淮山炭疽病菌致病力分化研究目前尚無報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)來源于我國南方6省（區(qū)）的45株淮山炭疽病菌在供試的4個(gè)淮山種質(zhì)材料上的致病力存在明顯差異，依據(jù)各供試菌株綜合致病力表現(xiàn)，分為強(qiáng)、中、弱3種致病類型，以中等致病類型菌株居多，占71.00%，與張眉等（2016）關(guān)于山東小麥蠕孢根腐病菌致病力分化、李江華等（2017）關(guān)于杧果炭疽病菌致病力分化，以及吳橋等（2017）關(guān)于黃瓜褐斑病菌致病力分化的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)淮山炭疽病菌致病菌類型的分布比例在不同地理來源問存在明顯差異，其中強(qiáng)致病性菌株分布于廣西，中致病性菌株分布于貴州、福建和海南，弱致病性菌株分布于四川和云南，表明我國南方淮山炭疽病菌的致病力分化與地理來源有一定的相關(guān)性，與李江華等（2017）、吳橋等（2017）的研究結(jié)果相似。究其原因，可能與不同省份淮山栽培品種、栽培氣候環(huán)境、防治用藥種類、菌株抗性等因素有一定關(guān)聯(lián)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

此外，本研究樣品的采集地區(qū)橫跨6?。▍^(qū)），各省份淮山種植區(qū)分布廣，樣品采集的代表性存在一定的局限性，同時(shí)各?。▍^(qū)）分離到的菌株數(shù)量差異較大，難以準(zhǔn)確反映不同來源地菌株的致病力。因此，本研究僅初步探討了我國南方淮山炭疽病菌的致病力分化情況，要深入了解我國南方淮山炭疽病菌致病力分化的原因，仍需大量采集樣品分離菌株，進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

4結(jié)論

本研究對分離自我國南方6?。▍^(qū)）的45株淮山炭疽病菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，45株炭疽病菌菌株均為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioide），其在培養(yǎng)特征和系統(tǒng)發(fā)育上存在多樣性差異，在致病力上存在分化，且受來源地的影響。

（責(zé)任編輯 麻小燕）