真核表達人生長激素促進家兔生長及免疫原性分析

陳金武 齊璐璐 段瑩瑩

摘要 [目的]獲得穩(wěn)定表達重組人生長激素的中華倉鼠卵巢細胞株，并分析目的蛋白體內促動物生長活性及免疫原性。[方法]PCR擴增獲得rhGH基因，構建重組表達質粒rhGH1 pOptiVEC，并進行雙酶切及測序鑒定。脂質體法轉染CHO/DG44 dhfr 細胞，利用SDS PAGE電泳及Western blot檢測目的蛋白，并用氨甲喋呤（MTX）加壓篩選陽性克隆。采用Co2+親和層析法純化rhGH。促去垂體家兔生長法檢測rhGH體內活性，同時采用ELISA雙抗夾心法檢測重組蛋白誘生抗體滴度，分析其免疫原性。[結果]PCR擴增得到696 bp的rhGH序列，雙酶切及測序結果顯示構建的rhGH1 pOptiVEC質粒正確。轉染細胞后，MTX加壓使得蛋白表達量明顯提高。純化的rhGH能夠促進去垂體家兔體重增加。誘生抗體滴度分析結果顯示該蛋白具有與市售商品化蛋白相似的免疫原性。[結論]真核表達rhGH蛋白能夠促進動物生長，可用于相關藥物研究。

關鍵詞 重組人生長激素；真核表達； 促生長活性；免疫原性

中圖分類號：R335；Q291 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2018）03-071-04

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.029

Abstract [Objective]To construct the stable expressing vector rhGH1 pOptiVEC for recombinant human growth hormone in CHO/DG44 dhfr cells and identified the growth promoting activity and immunogenicity. [Methods]rhGH gene was amplified by PCR. The PCR product and pOptiVEC vector were digested by double enzymes. Then the two digested products were jointed together with T4 ligase. Then the plasmid was transfected to CHO/DG44 dhfr cells and the positive clones were further screened by different concentration of MTX. The target protein was purified by Co2+ affinity chromatography and analyzed by SDS PAGE electrophoresis & western blot. The body weight gain tests of hypophysectomized rabbits were carried out for potency determination of rhGH in vitro. Rabbits were immunized with rhGH and the serum antibody was also determined by ELISA.[Results]The rhGH1 pOptiVEC vector was constructed correctly， which was proved by double enzymes digestion and DNA sequencing. The positive CHO/DG44 dhfr clones could stably express rhGH with 1000 nmol/L MTX and the molecular mass of the target protein was about 23 kDa. rhGH could be purified to a high concentration（90%）by Co2+ affinity chromatography. It also could promote hypophysectomized rabbits to grow up. The antibody induced by rhGH was similar to that induced by the commercially available drug.[Conclusions]The CHO/DG44 dhfr cells which can highly express rhGH had been successfully constructed. The rhGH protein with the similar growth promoting activity and immunogenicity to the commercially available drug had been also obtained.

Key words Recombinant human growth hormone（rhGH）；Eukaryotic expression；Growth promoting activity；Immunogenicity

人生長激素（human growth hormone，hGH）是一個由191個氨基酸殘基組成的非糖基化蛋白質激素[1]，分子量為22 KDa。該蛋白由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌，蛋白質分泌量一般在青春期達到最大值[2-3]。目前人生長激素主要用于治療兒童的生長障礙和成人生長激素缺乏癥（GHD），且具有良好的效果。同時，生長激素也被批準用于特納綜合癥、慢性腎功能不全、兒童特發(fā)性身材矮小、燒傷燙傷手術后的恢復以及脂肪積累相關的成人脂肪代謝障礙等[4]。早期，hGH主要來自于人類尸體腦垂體，產(chǎn)量非常低，因此科學家嘗試多種途徑人工合成GH。重組人生長激素（recombi nant hGH，rhGH）是一種非天然的，由重組DNA技術生產(chǎn)的基因工程藥物，最早由Martial等通過大腸桿菌中的原核表達而獲得。因此，直到1979年開發(fā)出第一個重組人生長激素，hGH才得以進行大規(guī)模的科學研究和商業(yè)應用[5-7]。

當前國內外眾多學者關注于重組人生長激素穩(wěn)定表達體系的構建。一個良好的載體需要具備能促進轉錄與翻譯的啟動子，同時要確保蛋白序列的穩(wěn)定性[8-9]。該次試驗構建了rhGH真核表達質粒，通過氨甲喋呤（MTX）加壓，在CHO/DG44細胞中成功表達rhGH。經(jīng)鑒定，該蛋白具有促進動物生長活性，且具有與市售蛋白相似的免疫原性。該結果為高效表達rhGH提供試驗支持，同時為rhGH在人體及動物相關疾病治療方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

感受態(tài)細菌E.coli DH5α、中華倉鼠卵巢細胞DG44 dhfr 細胞株（CHO/DG44 dhfr ）由合肥師范學院生命科學學院保存。pOptiVEC質粒、含hGH CDS序列的質粒GC hGH1由合肥師范學院生命科學學院保存；成年家兔（雌性，1.8～2.2 kg），購自安徽醫(yī)科大學試驗動物中心。PrimeSTAR HS DNA ploymerase購自TAKARA公司；T4 DNA ligase、dNTPs、Nhe I、Cla I限制性內切酶、Pre stained protein Marker、Unstained protein Marker、BCA定量試劑盒、Lipofectamine 2000轉染試劑、氨甲喋呤（MTX）、無血清培養(yǎng)基CD Opti CHOTM Medium均購自Thermo Fisher公司；DNA分子量Marker購自天根生化科技有限公司；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購自成都福際生物公司；alpha MEM（+）、alpha MEM（-）培養(yǎng)基購自GIBOCO公司；胎牛血清購自HyClone公司；注射用重組人生長激素由自安科生物惠贈；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 表達載體rhGH1 pOptiVEC的構建

根據(jù)GenBank公布的hGH CDS序列設計引物，該引物由金唯智生物科技有限公司合成。上游引物rhGH1 F：5 attgctagcgccaccatggctacaggct 3、下游引物rhGH1 R：5 ttaatcgatctaatgat gatgatgatgatggaagccacagctg 3。rhGH 1 F含Nhe I酶切位點（GCTAGC）、Kozak序列、保護堿基。rhGH1 R含Cla I酶切位點（ATCGAT）、6×His Tag、終止密碼子、保護堿基。

以GC hGH1質粒為模板，使用上述引物經(jīng)PCR擴增獲得rhGH表達片段。PCR體系：去離子水32.5 μl、5×反應緩沖液10.0 μl、dNTP Mix 4.0 μl、上下游引物各1.0 μl、模板1.0 μl、PrimeStar DNA聚合酶0.5 μl。擴增參數(shù)為：98℃預變性2 min，98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次后72℃延伸2 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并用膠回收試劑盒回收。

用Nhe I、Cla I雙酶切PCR產(chǎn)物及真核表達載體pOptiVEC。膠回收雙酶切產(chǎn)物，用T4連接酶16℃連接過夜，再將連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素篩選陽性單克隆。對陽性克隆菌進行擴大培養(yǎng)，并提取無內毒素的重組質粒。經(jīng)雙酶切及測序鑒定后，將正確的真核表達質粒命名為rhGH1 pOptiVEC。

1.3 MTX加壓建立穩(wěn)定表達細胞株

1.3.1 轉染CHO/DG44 dhfr 細胞 將CHO/DG44 dhfr 細胞接種于alpha MEM（+）（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。參照Lipo fectamineTM2000轉染說明書，用重組質粒rhGH1 pOptiVEC轉染CHO/DG44 dhfr 細胞，48 h后改用alpha MEM（-）（含5%胎牛血清）進行選擇性培養(yǎng)，每72 h更換培養(yǎng)基1次，使用G418進行篩選。同時設置未轉染的CHO/DG44 dhfr 細胞及轉染空載體細胞為對照組。

1.3.2 親和層析法純化rhGH蛋白 將篩選得到的陽性細胞克隆培養(yǎng)2～3 d后，離心（5 000 r/min，5 min）收集培養(yǎng)基上清液，置于透析袋內經(jīng)PEG20000吸水濃縮4 h，再參照Talon Metal Affinity Resin說明書，采用Co2+親和層析法純化目的蛋白。吸取適量Co2+ beads置于空柱中，待beads完全沉淀后，添加10 ml磷酸鹽緩沖液平衡柱子。培養(yǎng)基上清倒入親和層析柱中，垂直旋轉1 h，使蛋白與beads充分結合。去塞子使上清流出，用10 ml磷酸鹽緩沖液洗柱2次，去除雜質。10 mmol/L咪唑洗脫緩沖洗柱2次，去除非特異性結合蛋白。150 mmol/L咪唑洗脫緩沖洗柱，獲得rhGH蛋白。將蛋白加入超濾管進行超濾，以TBS 緩沖液（Tris 3.028 g NaCl 8.766 g）為超濾緩沖液，超濾5次。最后倒置超濾，獲得目的蛋白。

1.3.3 SDS PAGE電泳及Western Blot檢測 采用SDS PAGE電泳法鑒定純化的目的蛋白。然后將凝膠上的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），經(jīng)5%脫脂奶粉封閉4 h后PBST（1×PBS + 0.1% Tween20）洗滌5次。用anti GH單克隆抗體孵育，洗滌并用HRP標記的兔抗小鼠二抗孵育。最后采用ECL法曝光顯影。

1.3.4 MTX加壓獲得穩(wěn)定表達細胞 對培養(yǎng)至匯合度90%且狀態(tài)良好的陽性細胞進行MTX加壓篩選。MTX濃度設為：50， 100， 200， 400， 800， 1 000，1 500 nmol/L，每個濃度加壓5代。待細胞在一個濃度MTX的條件下生長到匯合度達90%時更換培養(yǎng)基為CD Opti CHOTM Medium，72 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，參照1.3.3方法檢測目的蛋白表達量。將表達量最高的克隆傳代培養(yǎng)，并進行下一個MTX濃度篩選。

獲得穩(wěn)定表達細胞后，采用1.3.2方法純化目的蛋白，取少量蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度，其余蛋白分裝經(jīng)液氮急凍再轉移至-80℃冰箱保存。

1.4 rhGH促去垂體家兔生長活性分析

參照文獻[10-11]，采用徒手定向穿刺法射頻毀損家兔垂體，建立去腦垂體家兔模型，并于動物房精心飼養(yǎng)2周后備用。將處理后家兔分為3組，即陽性對照注射用重組人生長激素組、目的蛋白rhGH組、陰性對照組，每組8只，記錄體重。陽性對照組、rhGH組對家兔每日1次經(jīng)頸部皮下給藥，劑量為40 μg/kg，連續(xù)給藥5周。陰性對照組給予含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的生理鹽水。

記錄每只動物給藥后體重與給藥前體重之差即：ΔW=Wi-W0，其中ΔW為體重增重；W0為給藥前體重；Wi為給藥后體重。以家兔體重增重ΔW為縱坐標，給藥時間T為橫坐標繪制體重增重-時間曲線。三組間用t檢驗顯著性差異，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

1.5 rhGH免疫原性分析

參照文獻[12-13]采用ELISA間接法檢測rhGH誘生抗體的能力來分析rhGH免疫原性。將體重約為2.0 kg的雌兔隨機分為3組，每組3只。每周一、四、日分別皮下注射給藥：rhGH、注射用重組人生長激素及生理鹽水，單次劑量為100 μg/kg，連續(xù)給藥3周。給藥后每周耳緣靜脈取血1次，離心取上清。將血清用PBS稀釋成1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000的滴度梯度作為一抗包被酶標板，洗滌酶標板后用BSA封閉，再用HRP-羊抗兔為二抗，OPD顯色并于酶標儀490 nm檢測吸收度（A490）。同時，設置空白血清孔，計算樣本孔與空白血清孔的A490比值，當A490樣本∶A490空白血清≥2.1，判斷該樣本抗體呈陽性。

2 結果與分析

2.1 rhGh1 pOptiVEC真核表達載體的構建

已知rhGH基因長度為696 bp，用1.2中引物PCR擴增后目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預期結果相符（圖1）。

獲得的重組質粒rhGH1 pOptiVEC經(jīng)Nhe I、Cla I雙酶切后，瓊脂糖電泳檢測，得到了分別與預期載體及插入片段長度相符的2條帶（圖2），表明目的片段已成功插入到表達載體中。將雙酶切鑒定正確的質粒送測序，結果顯示序列正確。

2.2 rhGH的SDS PAGE電泳及West ern Blot檢測

將轉染后細胞進行無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。72 h后離心收集培養(yǎng)基上清，采用Co2+親和層析法純化帶His標簽的rhGH蛋白。純化過程中經(jīng)咪唑梯度濃度洗脫，選擇最適洗脫濃度，最終選用150 mmol/L咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。親和層析法純化的rhGH蛋白進行SDS PAGE電泳，如圖3所示，目的蛋白分子量約為23 kDa，與預期大小一致，且純化蛋白純度達90%，純化方法可用于大量蛋白提取。用anti hGH單克隆抗體對目的蛋白進行Western blot鑒定，結果如圖4所示，在約23 KDa處有信號，說明純化的蛋白為rhGH。

2.3 MTX濃度對蛋白表達的影響

用不同濃度MTX對轉染細胞進行加壓篩選，經(jīng)蛋白純化后對目的蛋白進行表達量分析，發(fā)現(xiàn)MTX濃度影響蛋白的表達。隨MTX濃度增加，蛋白表達量明顯升高（表1）。當MTX濃度達到1 000 nmol/L時，表達量最高，而MTX濃度進一步增大時，蛋白表達量無明顯增加。因此，在轉染細胞培養(yǎng)時，選擇1 000 nmol/L MTX加壓。

2.4 rhGH體內促去垂體家兔生長活性檢測

由去垂體家兔凈增體重-時間曲線（圖5）可以得出，注射rhGH和陽性對照的去垂體家兔在6周內體重明顯增加。因生長激素體內代謝較快，體內活性無法長期維持，所以給藥第5周后2組家兔體重增幅減緩。注射含牛血清白蛋白生理鹽水的對照組家兔在6周內體重沒有明顯變化。而rhGH組與陽性對照組體重增加沒有明顯差異，同樣能顯著地促進去垂體家兔體重增加。由此可見，經(jīng)該次試驗構建的真核表達系統(tǒng)表達純化出的rhGH具有促進生長的活性。

2.5 rhGH免疫原性分析

對經(jīng)rhGH蛋白免疫的家兔提取血清，在490 nm處檢測檢測誘生抗體的低度。以空白血清作為陰性對照，當A490樣本∶A490空白血清≥2.1時，可判斷該家兔產(chǎn)生了抗rhGH的抗體。從圖6可以看出，注射了rhGH的家兔在1周后即開始產(chǎn)生抗體，且抗體滴度在2周后快速達到最大值。隨著rhGH在體內的代謝，抗體滴度在維持一定時間后逐漸下降。rhGH與商品化的注射用重組人生長激素在抗體滴度以及維持時間方面沒有明顯差異。生理鹽水組抗體一直呈陰性，故圖中不顯示。

3 結論與討論

作為一種多肽激素，GH是調控有機體細胞生長的主要作用因子。其通過刺激體細胞的增大和數(shù)量增多，進而促進有機體所有組織的發(fā)育和增大。此外，生長激素對免疫系統(tǒng)的影響也受到關注。有報道稱，生長激素對T細胞、B細胞、胸腺細胞、NK細胞及單核巨噬細胞等均有調節(jié)作用，并能影響IL 2、IL 2R、IFN γ和TNF α等細胞因子的分泌，與機體的免疫系統(tǒng)關系密切[14]。目前，hGH的基因工程產(chǎn)品已用于多種疾病的治療[15-17]，但由于hGH半壽期很短，必須長期注射，這就導致病患各種各樣的副作用，且費用高，在一定程度上影響其廣泛的臨床應用[18-19]。

在該次研究中，參照GenBank設計rhGH的擴增引物，使得表達序列帶有His純化標簽，同時序列保留信號肽部分，便于細胞表達后蛋白的收集。然后將rhGH與pOptiVEC連接，構建了rhGH1 pOptiVEC真核表達質粒。該質粒上含有IRES序列，因而可以將目的基因和DHFR基因連接在一起構建雙順反子表達載體，以共同的效率和比例表達目的基因和DHFR基因。其次，該次試驗選用CHO/DG44 dhfr 細胞穩(wěn)定表達rhGH。該細胞在真核表達方面具有多重優(yōu)勢。外源蛋白在CHO細胞中能夠以分泌形式釋放到培養(yǎng)基中，且蛋白可進行折疊、切割以及修飾加工，使得其結構和功能均與天然蛋白相似。同時，該細胞為二氫葉酸還原酶（dhfr）缺陷型，在MTX選擇壓力下，編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴增而擴增，大幅提高蛋白產(chǎn)量。文中當MTX濃度為1 000 nmol/L時，rhGH蛋白表達量達到最高。將該重組蛋白作用于去垂體家兔，可在6周內促進家兔體重增加。同時通過免疫動物，分析該蛋白免疫原性。7周內，該重組蛋白誘生抗體滴度與注射用重組人生長激素相似。以上結果表明，該次試驗所建立的真核表達系統(tǒng)可表達出大量rhGH，且該重組蛋白無論是體內活性亦或是免疫原性，均與市售的注射用藥物相似。

該次試構建的rhGH真核表達系統(tǒng)為大規(guī)模制備rhGH提供了一定的參考依據(jù)，也為研究hGH的各種生理功能、作用機制以及人體及家畜相關疾病的治療奠定了基礎。

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責任編輯：劉赟