利莫那班對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的抑制作用及其機制研究

扈曉霞 韓世飛 李晶

摘 要 目的：研究利莫那班對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導心肌細胞肥大的抑制作用及其機制。方法：取大鼠心肌細胞接種于6孔板中，密度調(diào)整為2×105 L-1，分為空白對照組、模型組、陽性對照組（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高濃度組（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5組加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大細胞模型，然后分別加入相應濃度的藥物，培養(yǎng)24 h后，觀察并測量每一個視野內(nèi)球形細胞的直徑和細胞數(shù)量，檢測心肌細胞中Ca2+濃度、一氧化氮（NO）含量、一氧化氮合酶（NOS）活性和Ⅰ型大麻受體（CB1）蛋白表達情況。結果：各組心肌細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與空白對照組比較，模型組心肌細胞直徑明顯增大，心肌細胞中Ca2+濃度和CB1蛋白表達水平均明顯增加，NO含量和NOS活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞直徑明顯縮小，心肌細胞中Ca2+濃度和CB1蛋白表達水平均明顯降低，NO含量和NOS活性明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且利莫那班組作用呈濃度依賴性。結論：利莫那班可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用機制可能與降低Ca2+濃度、下調(diào)CB1蛋白表達有關。

關鍵詞 利莫那班；血管緊張素Ⅱ；心肌細胞肥大； Ca2+濃度；Ⅰ型大麻受體

中圖分類號 R915；R966 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2921-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.10

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of rimonabant on cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ（Ang Ⅱ） and its mechanisms. METHODS： Rat cardiomyocytes were incubated in 6 well culture plates with density of 2×105 L-1. They were divided into blank control group， model group， positive control group （losartan10 μmol/L）， rimonabant low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups （0.1，1.0， 5.0 μmol/L）. The latter 5 groups were cultured with 0.1 μmol/L Ang Ⅱ to induce cardiomyocyte hypertrophy model， and then given relevant concentration of drugs. After cultured with 24 h， diameter and number of spherical cells in each field of vision were observed and measured. The Ca2+ concentration， NO content， NOS activity and protein expression of cannabinoid receptor 1（CB1） in cardiomyocyte were determined. RESULTS： There was no statistical significance in the number of cardiomyocyte （P>0.05）. Compared with blank control group， the diameter of cardiomyocytes in model group increased， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were increased significantly； NO content and NOS activity decreased significantly， with statistical significance （P<0.05）. Compared with model group， the diameter of cardiomyocytes in positive control group， rimonabant low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups were decreased significantly， and Ca2+ concentration and protein expression of CB1 in cardiomyocytes were decreased significantly； NO content and NOS activity increased significantly， with statistical significance （P<0.05）， and the effects of the rimonabant groups were dose-dependent. CONCLUSIONS： Rimonabant can inhibite cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡ， the mechanism of which may be associated with the decrease of Ca2+ concentration and protein expression of CB1.

KEYWORDS Rimonabant； AngiotensinⅡ； Cardiomyocyte hypertrophy； Ca2+ concentration； Cannabinoid receptor 1

利莫那班是人類發(fā)現(xiàn)的首個Ⅰ型大麻受體（CB1）抑制劑，利莫那班作為新型減肥藥，2006年在歐盟批準上市，用于超質(zhì)量或肥胖的成人患者[1]。此外，利莫那班對調(diào)節(jié)人體胰島素增敏、輔助戒煙、改善患者脂代謝紊亂具有輔助作用[2]。但是由于利莫那班有可能會增加患者精神方面風險，賽諾菲-安萬特（Sanofi-Aventis）公司于2007年6月29日宣布撤消其在美國的新藥上市申請[3]。近年來，人們不斷研究證實，生理濃度下內(nèi)源大麻素在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學效應，如心血管效應、抗炎及保護內(nèi)皮細胞等作用[4]。有研究者報道，利莫那班可通過下調(diào)鈣離子（Ca2+）-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）、心肌營養(yǎng)素1（CT-1）的表達顯著改善慢性間歇低氧誘發(fā)的心肌肥厚[5-6]。為進一步探討CB拮抗對肥大的原代乳鼠心肌細胞的影響及可能機制，本實驗室通過前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，CB1廣泛表達于人腎臟上皮細胞HEK293中，參與到HEK293細胞一系列的生理過程中。但拮抗CB1與心肌細胞肥大是否同樣存在相關性，尚未見報道。本實驗用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導原代乳鼠心肌細胞建立心肌肥大細胞模型，研究利莫那班對心肌細胞肥大的抑制作用及其機制，為CB1抑制劑利莫那班預防心血管系統(tǒng)疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

qTOWER2.0型熒光定量多聚酶鏈式反應（PCR）儀 和Chemstudio SA2型多功能成像系統(tǒng)（德國耶拿公司）；Gene Pulser Xcell型電轉儀（美國Bio-Rad公司）；D- 35578 Wetzlar型Leica熒光顯微鏡（德國Leica Microsystems公司）；紫外-可見分光光度計（美國Beckman公司）；SpectraMax M4型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 藥品與試劑

利莫那班（批號：20170506，純度：≥99.8%）和Ang Ⅱ（批號：HZB0537，純度：>99%）均購自美國Sigma公司；氯沙坦鉀膠囊（北京萬生藥業(yè)有限公司，批號：H20080015，規(guī)格：每粒50 mg）；小牛血清（批號：16010-159）和DMEM培養(yǎng)基（批號：11995-065）均購自美國Invitrogen Gibco公司；SYBR?GREEN PCR Master Mix（美國Applied Biosystem公司）；CB1基因引物與Ca2+熒光探針（上海吉凱基因化學技術有限公司）；生物素化抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：TA319567）、辣根過氧化物酶（HRP，批號：HZB0173）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：A5441）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號：TA309157）均購自北京中杉金橋生物技術公司；兔抗鼠CB1一抗（批號：A-AP19620c）、反轉錄試劑盒（批號：AK5602）均購自重慶卓諾生物技術有限公司；一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的測定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml059067）。

1.3 動物

清潔級，新生1～2 d SD大鼠，50只，♂，體質(zhì)量5.5～6.5 g，來源于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號為SYXK（渝） 20022007，本實驗通過重慶三峽中心醫(yī)院倫理委員會同意開展相關動物實驗研究。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與鑒別

無菌條件下，取新生1～2 d SD大鼠心室肌，切碎成1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶和D-Hanks消化液混懸后，于37 ℃磁力攪拌消化10 min左右，反復數(shù)次，直至碎片完全消化，吸出上清液，加入含5%小牛血清的培養(yǎng)液終止消化。收集分離包含心肌細胞的小牛血清DMEM 培養(yǎng)液，梯度貼附法去除心肌周圍細胞，以 5×105 L-1密度接種于6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，換DMEM 培養(yǎng)基適應性培養(yǎng)10 h。免疫組化細胞學鑒定心肌細胞：心肌細胞培養(yǎng)在6孔板中，檢測時用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗去除血清和雜質(zhì)，4%多聚甲醛固定15 min；1%牛血清白蛋白封閉30 min；加β-actin一抗（稀釋比例1 ∶ 500），4 ℃過夜；次日加生物素化抗鼠IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 500），37 ℃孵育30 min；加HRP標記的鏈酶卵白素；3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染胞核，系列酒精脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。心肌細胞貼壁生長，單細胞有1～2個核，最終形成放射排列同心圓；培養(yǎng)24 h后心肌細胞開始出現(xiàn)自發(fā)性搏動；免疫組化細胞學鑒定顯示，胞質(zhì)棕黃色絲狀物為免疫化學染色陽性心肌細胞，陽性率達98%以上，可滿足進一步試驗需求。

2.2 分組與給藥

試驗分為空白對照組、模型組、陽性對照組（氯沙坦10 μmol/L）和利莫那班低、中、高濃度組（0.1、1.0、5.0 μmol/L），后5組加入0.1 μmol/L AngⅡ建立心肌肥大細胞模型，然后改為含相應濃度藥物的DMEM 培養(yǎng)液（用二甲基亞砜溶解利莫那班后DMEM稀釋，配制成濃度分別為0.1、1.0、5.0 μmol/L標準液），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測。

2.3 心肌細胞計數(shù)與大小的測定

心肌細胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項下分組給藥，加藥培養(yǎng)24 h后，用D-Hanks液快速沖洗長滿細胞的培養(yǎng)皿3次，加入0.25%胰蛋白酶，消化8 min后，加入10%小牛血清培養(yǎng)液終止消化。顯微鏡下觀察細胞形狀，在每一個視野內(nèi)按白細胞計數(shù)法對心肌細胞進行計數(shù)，并用測微器測量心肌細胞的直徑。

2.4 熒光探針測定心肌細胞中Ca2+濃度

心肌細胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項下分組給藥，每組3個復孔，加藥培養(yǎng)24 h后用無菌PBS清洗5次，加入終濃度為3 ?mol/L的Ca2+熒光探針，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，PBS清洗5次，加入培養(yǎng)基，通過熒光顯微鏡4′ ，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）濾光片下觀察，以340 nm為激發(fā)波長，510 nm為吸收波長，測定灰度值（F值）。根據(jù)預先建立的F值與Ca2+濃度之間的相互關系，計算Ca2+濃度。

2.5 測定心肌細胞中NO 含量和NOS 活性

心肌細胞以2×105 L-1密度接種于6孔板中，按“2.2”項下分組給藥，每組3個復孔，加藥培養(yǎng)24 h后，收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書測定心肌細胞中NO含量和NOS活性。

2.6 Western blot法測定心肌細胞中CB1蛋白表達

取各組細胞加藥培養(yǎng)24 h后，胰酶消化，用預冷的PBS清洗3次，加入裂解緩沖液100 μL裂解細胞，超聲破碎細胞膜，15 000 r/min（離心半徑9 cm）離心20 min，提取上清液蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白濃度。取3～5 ?L蛋白樣本上樣，行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳分離后轉膜，在含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉2 h。加入一抗兔抗大鼠CB1抗體（稀釋比例1 ∶ 300），4 ℃孵育過夜，加入HRP標記二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000），室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯色。以目標蛋白與內(nèi)參GAPDH的吸光度值（OD值）比值為相對表達量，評價目的蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果以x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 心肌細胞計數(shù)與大小的變化

顯微鏡下，心肌細胞均呈球形。各組心肌細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與空白對照組比較，模型組心肌細胞直徑明顯增大（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞直徑明顯縮?。≒<0.05）。與陽性對照組比較，利莫那班低濃度組心肌細胞直徑明顯增大（P<0.05）。各組心肌細胞數(shù)量、直徑的測定結果見表1。

3.2 心肌細胞中Ca2+濃度變化

與空白對照組比較，模型組心肌細胞中Ca2+濃度明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞中Ca2+濃度明顯降低（P<0.05）。與陽性對照組比較，利莫那班低濃度組心肌細胞中Ca2+濃度明顯升高（P<0.05）。各組細胞中Ca2+的熒光染色圖見圖1，Ca2+濃度測定結果見表1。

3.3 心肌細胞中NO含量和NOS活性的變化

與空白對照組比較，模型組心肌細胞中NO含量和NOS 活性明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞中NO含量和NOS 活性明顯增加（P<0.05）。與陽性對照組比較，利莫那班低、中濃度組心肌細胞中NO含量和NOS 活性明顯降低（P<0.05），利莫那班低、高濃度組心肌細胞中NO含量和NOS 活性差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組細胞中NO含量和NOS活性的測定結果見表2。

3.4 心肌細胞中CB1蛋白表達變化

與空白對照組比較，模型組心肌細胞中CB1蛋白相對表達量明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞中CB1蛋白相對表達量明顯減少（P<0.05）。與陽性對照組比較，利莫那班低、中濃度組心肌細胞中CB1蛋白相對表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05） 。各組細胞中CB1蛋白表達的電泳圖見圖2，CB1蛋白相對表達量的測定結果見表2。

4 討論

我國心血管疾病患病人數(shù)處于持續(xù)上升階段，心血管疾病病死率居死亡率首位[8]。心肌細胞肥大是導致心臟疾病和心臟猝死的危險因素，抑制心肌細胞肥大備受關注[9-10]。心肌接受刺激發(fā)生代償，在最初代償期心肌可提高心臟泵血功能，在病因持久作用下，肥大心肌功能失去代償功能而轉變?yōu)樾乃?，尋找針對心肌肥大的治療策略一直是心血管疾病研究領域的熱點之一。

Ang Ⅱ是公認的促心肌肥大因子，本研究采用Ang Ⅱ誘導建立體外心肌肥大細胞模型，倒置顯微鏡觀察顯示模型組心肌細胞直徑顯著增加（P<0.05），心肌細胞腫脹和分界不清的病理改變，提示心肌肥大細胞模型建立成功，Ang Ⅱ增加模型組心肌細胞胞膜CA1蛋白表達，而拮抗CB1可降低胞膜CB1的表達且隨著利莫那班濃度增加呈濃度依賴性。有研究顯示，CB1活性升高可增加食欲、促進攝食等[11-12]，同時周圍組織能量代謝異常，可引起體質(zhì)量增加，引發(fā)血脂異常，造成心肌細胞肥大。利莫那班可選擇性抑制CB1，臨床已有研究結果顯示，拮抗CB1可減輕炎癥、改善代謝、降低血壓、抑制動脈粥樣硬化發(fā)展[13]。心肌細胞Ca2+濃度升高是導致心肌肥大的基本信號，胞內(nèi)Ca2+濃度升高可激活Ca2+敏感的鈣調(diào)磷酸酶（CaN），活化T細胞核因子3和鋅指轉錄因子，激活多個相關基因如心鈉素（ANF）等表達，促進心肌肥大。國外有文獻報道，CB1激動后也可促進胞內(nèi)“鈣池”釋鈣和Ca2+離子跨膜轉運增加。本試驗模型組心肌細胞中Ca2+濃度顯著高于正常對照組，這一結果與前人研究[13-14]結果吻合。利莫那班低、中、高濃度組心肌細胞中Ca2+濃度顯著低于模型組，筆者推測利莫那班拮抗CB1受體可能通過抑制Ca2+釋放和抑制突觸后電位，降低心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。NO能抑制心肌細胞分裂和增殖，其激活鳥苷酸環(huán)化酶而抑制L型Ca2+內(nèi)流，最終減弱核轉錄因子（NFAT）核移位和轉錄活性，發(fā)揮抗心肌肥大的作用。本研究結果顯示，利莫那班能明顯增強NOS的活性（P<0.05）、促進NO的釋放（P<0.05），這一作用對心肌細胞肥大也具有保護作用。

近年研究人們發(fā)現(xiàn)花生四稀酸乙醇胺等內(nèi)源性大麻素在糖代謝紊亂、氧化應激、炎癥因子活化等生理病理過程發(fā)揮重要作用[15-16]，CB1表達一定程度上可評價體內(nèi)大麻系統(tǒng)發(fā)生的變化[17]。本研究結果證實，利莫那班能明顯降低Ang Ⅱ誘導的心肌肥大細胞中CB1的表達、抑制心肌細胞中Ca2+濃度的升高和增強NOS活性并促進NO的釋放，其作用效果與氯沙坦相當。有關CB1拮抗藥對心肌肥大作用的影響及其細胞學機制目前并不完全清楚，其可能通過拮抗CB1，調(diào)節(jié)食欲、攝食、糖脂代謝、能量代謝、氧化應激、血脂異常等病理過程發(fā)揮改善心肌細胞肥大效應[12，18-19]。

綜上所述，利莫那班對Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大具有抑制作用，呈濃度依賴性，抑制機制可能與降低Ca2+濃度、下調(diào)CB1蛋白表達有關，這一研究結果提示CB1可作為防治心室肥厚的潛在靶點，具有潛在應用前景。

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（收稿日期：2018-03-19 修回日期：2018-09-18）

（編輯：鄒麗娟）