瞿彬 張蓉 楊云霜 李延暉 趙雪

摘要 目的：觀察不同方藥對輻射抗氧化能力的干預作用。方法：72只C57BL/6J小鼠（20±2）g，雌雄各半。雌鼠與雄鼠分別隨機分為空白對照組、輻射模型組、輻射模型+補腎解毒方組，每組各12只。除空白對照組外，其余小鼠均施予60CO γ-射線全身照射，吸收劑量分別為5 Gy。均于照射后第1天、第14天取材，每組每次6只。隨后斷頭取腦，在冰盤上剝離大腦，摘取兩側(cè)下丘腦，將其充分研磨使組織勻漿化，制成10%勻漿。采用酶聯(lián)免疫法（ELLSA），嚴格按SOD、MDA檢測試劑說明書操作，檢測SOD活性及MDA含量，觀察下丘腦胞質(zhì)SOD、MDA水平，作出中藥對輻射抗氧化能力干預作用的分析。結果：各組小鼠SOD活性，經(jīng)輻射后14 d輻射模型組（110.26±5.50）與空白對照組（127.34±4.38）比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），補腎解毒方組（130.98±4.55）、空白對照組均與輻射模型組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；輻射模型組、補腎解毒方組在輻射后第14天與其第1天（126.41±4.95、120.05±7.17）比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組小鼠MDA數(shù)值變化，經(jīng)輻射后1 d、14 d空白對照組（6.99±1.85、6.93±1.82）、補腎解毒方組（9.82±0.70、6.95±1.43）均與輻射模型組（126.41±4.95、17.88±3.39）比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），輻射后1 d補腎解毒方組、輻射模型組均與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），輻射后14 d僅輻射模型組與空白對照組間比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；輻射后14 d僅補腎解毒方組與其輻射后1 d比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

關鍵詞 中藥；下丘腦；抗氧化能力；輻射；小鼠

Abstract Objective：To observe the effect of different prescriptions on the antioxidant capacity of radiation. Methods：A total of 72 C57BL / 6J mice weighting （20±2）g， with 10 male and 10 female were obtained. Female rats and male rats were randomly divided into blank control group， radiation model group， radiation model+kidney detoxification group， with 12 in each group. Except the blank control group， the remaining mice were given 60CO γ-ray whole body irradiation， and absorbed dose were 5 Gy. Materials were taken on 1 d and 14 d after irradiation with 6 mice of each group each time. Then the head was cut， and the brain was removed from the ice plate. And the two sides of the hypothalamus were removed， and the tissue was homogenized to make 10% homogenate. By enzyme-linked immunosorbent assay （ELLSA）， SOD MDA kit， in strict accordance with the instructions， the numerical SOD activity and MDA detection were observed in the hypothalamus of intracellular SOD and MDA levels， to analyse the effect of Chinese materia medica on the antioxidant capacity of radiation intervention. Results：The mice of SOD activity， with the radiation of 14 d radiation model group （110.26±5.50） and control group （127.34±4.38） had significant statistical difference （P<0.01）. Bushen Jiedu Decoction group （130.98±4.55） and blank control group had statistically significant differences with the model group （P<0.01）； Compared with 1 d （126.41±4.95， 120.05±7.17）， the model group and Bushen Jiedu decoction group had significant statistical differences on 14 d after the radiation （P<0.01）. For mice MDA value changes， there were significant differences in control group （6.99±1.85， 6.93±1.82）， Bushen Jiedu Decoction group （9.82±0.70， 6.95±1.43） and model group （126.41±4.95， 17.88±3.39） at 1 d， 14 d after the radiation （P<0.01）. Bushen Jiedu Decoction group， model group and blank control group have significant difference at 1 d after radiation （P<0.01）. At 14 d after radiation， only the radiation model group had significant difference between blank control group （P<0.01）； Bushen Jiedu Decoction group had significant difference between 14 d and 1 d after radiation （P<0.01）.

Key Words Chinese materia medica； Hypothalamus； Antioxidant capacity； Radiation； Mouse

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.046

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

C57BL/6J小鼠20±2g 75只，雌雄各半。北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：[SCXK（京）2012-0001]。自由進水攝食，普通顆粒飼料飼養(yǎng)，北京師范大學生命科學院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物

補腎解毒方（熟地黃10 g、山茱萸12 g、山藥10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、冬蟲夏草3 g、白花蛇舌草10 g組成）。上述中藥由北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥顆粒劑配制而成。按人體給藥量換算成大鼠等效劑量作為小鼠給藥量，小鼠給藥劑量為13.5 g/（kg·d）。

1.1.3 試劑與儀器

酶聯(lián)免疫試劑盒（北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，96 T）；電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司，型號：00000246）；60Coγ射線輻射裝置（北京伽瑪高新有限公司，型號：GM-11-030A）；高速臺式冷凍離心機（上海天美科學儀器有限公司，型號：CT15RT）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

雌鼠與雄鼠分別隨機分為3組。空白對照組、輻射模型組、輻射模型+補腎解毒方組，每組12只。除空白組外，其余小鼠均接受一次性5Gy 60CO γ-射線全身照射。

1.2.2 給藥方法

正式實驗開始后，每天上午8：00給予中藥干預組灌胃中藥，給予空白對照組、輻射模型組等容積的生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d，第11天進行一次性5Gy 60CO γ-射線照射，照射后繼續(xù)給藥14 d。

1.2.3 檢測指標與方法

小鼠分別于輻射后第1天、14天取材，每組每次6只，隨后斷頭取腦，在冰盤上剝離大腦，摘取兩側(cè)下丘腦，將其充分研磨使組織勻漿化，制成10%勻漿。采用酶聯(lián)免疫法（ELLSA），嚴格按SOD、MDA檢測試劑說明書操作，檢測SOD活性及MDA含量，觀察下丘腦胞漿SOD、MDA水平，并將各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，綜合上述兩項試驗數(shù)據(jù)結果，作出中藥對輻射抗氧化能力干預作用的分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 抗氧化能力分析，測定下丘腦胞漿SOD、MDA水平，并將各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗，所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以P<0.05為有統(tǒng)計學意義，以P<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下丘腦胞質(zhì)SOD活性（U/mgprot） 1）經(jīng)單因素方差分析，空白對照組雌雄小鼠SOD活性無統(tǒng)計學意義（P>0.05），即未經(jīng)輻射的C57BL/6J小鼠SOD活性雌雄間無統(tǒng)計學意義。2）經(jīng)輻射后1 d 3組小鼠間無統(tǒng)計學意義，輻射后14 d輻射模型組與空白對照組比較有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），補腎解毒方組、空白對照組均與輻射模型組具有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），而補腎解毒方組則與空白對照組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；輻射模型組、補腎解毒方組在輻射后第14天與其第1天比較有顯著性統(tǒng)計學意義（P<0.01），空白對照組無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。3）分別對雌、雄小鼠各組用單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輻射后雌、雄小鼠各組SOD活性動態(tài)變化分析結果并無統(tǒng)計學意義。

2.2 下丘腦胞質(zhì)MDA含量（nmol/mgprot） 1）經(jīng)單因素方差分析，空白對照組雌雄小鼠MDA數(shù)值無統(tǒng)計學意義（P>0.05），即未經(jīng)輻射的C57BL/6J小鼠MDA含量雌雄間無統(tǒng)計學意義。2）經(jīng)輻射后1 d、14 d空白對照組、補腎解毒方組均與輻射模型組有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），補腎解毒方組與空白對照組間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；輻射后1 d補腎解毒方組、輻射模型組均與空白對照組有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），輻射后14 d僅輻射模型組與空白對照組間存在明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），補腎解毒方組與空白對照組間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；輻射后14 d僅補腎解毒方組與其輻射后1 d比較存在明顯統(tǒng)計學意義（P<0.01），其他2組均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。3）分別對雌、雄小鼠各組用單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輻射后雌、雄小鼠各組MDA含量動態(tài)變化分析結果并無統(tǒng)計學意義。

3 討論

在科技飛速發(fā)展的今天，核技術被人們越來越多的應用于各個領域，小到平日生活通訊烹飪就醫(yī)的電離輻射，大到各國不斷改進研發(fā)用于戰(zhàn)備的核輻射，可以說輻射無處不在[1]。自由基廣泛存在于生物體內(nèi)，在正常生理情況下，其處于生成與清除的平衡狀態(tài)，不損害機體且有降解毒物的作用[2]。機體在射線的激發(fā)下，OH·、H·等自由基轉(zhuǎn)化為氧自由基，自由基的原始平衡被打破，進而引發(fā)不同程度的氧化損傷[3]。超氧化物歧化酶（SOD）是一種存在于腦組織中可有效清除氧自由基的抗氧化酶，對機體氧化與抗氧化平衡有非常重要的作用，它間接反映機體清除氧自由基的能力[4]。丙二醛（MDA）是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的氧化終產(chǎn)物，MDA含量的高低則直接反映了機體脂質(zhì)過氧化的程度。因此SOD、MDA在腦組織中的含量的動態(tài)變化，可直接或間接的反映機體對輻射的抗氧化能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輻射后1 d輻射模型組及補腎解毒方組小鼠SOD活性均稍有下降但并未與空白對照組存在統(tǒng)計學意義，而MDA含量輻射模型組及補腎解毒方組較空白對照組已顯著提高。經(jīng)輻射14 d輻射模型組小鼠SOD活性進一步下降，且此時已與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義；而補腎解毒方組小鼠SOD活性卻比1 d明顯回升了，且此時與輻射模型組差異顯著，與空白對照組不存在統(tǒng)計學意義。此時MDA含量補腎解毒方組較1 d出現(xiàn)明顯下降，與輻射模型組比較有統(tǒng)計學意義，與空白對照組無統(tǒng)計學意義，而輻射模型組MDA含量雖與1 d相比變化不明顯，但仍顯著高于空白對照組及補腎解毒方組。

本研究補腎解毒方由六味地黃丸、白花蛇舌草及冬蟲夏草3種成分組成?！傲兜攸S丸”為源自北宋名醫(yī)錢仲陽的經(jīng)典名方，由醫(yī)圣張仲景的金匱腎氣丸衍化而來，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓六味中藥組成，被譽為“補陰方藥之祖”，具有滋陰補腎之功能，是治療腎陰不足的基本方[5]。相關文獻記載，其對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有一定改善作用。六味地黃丸具有抑制氧自由基生成的作用，其組成成分中熟地黃還具有防止細胞中的過氧化酶和自由基生成過多的臨床應用效果[6]。胡明才，何建華等通過六味地黃丸對2型糖尿病伴胰島素抵抗并發(fā)周圍神經(jīng)病變大鼠的抗氧化作用的觀察中發(fā)現(xiàn)[7]，六味地黃丸能提高2型糖尿病伴胰島素抵抗大鼠血液SOD活性，減少MDA生成，減輕機體氧化應激性損傷。冬蟲夏草性溫味甘，入肺腎經(jīng)，能補肺益腎、止血化痰，用于久咳虛喘、勞嗽咯血、陽痿遺精、腰膝酸痛等癥[8]。相關文獻中記載，顧宇翔[9]等報道蟲草及其發(fā)酵制品可作為一種潛在的天然抗氧化劑。盛路[10]等報道蟲草菌酸性胞外多糖（EPS-A）具有顯著抗氧化能力，能顯著提高體外培養(yǎng)細胞的抗氧化能力，逆轉(zhuǎn)因移植腫瘤而引起的小鼠組織中MDA的升高和SOD的降低，同時顯著抑制腫瘤生長。張敏玲[11]研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草具有較強的抗自由基損傷和抗脂質(zhì)過氧化損傷作用，服用冬蟲夏草可減輕運動所產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基對小鼠的傷害；且對小鼠肝細胞膜有保護作用，可減少組織酶的外泄。白花蛇舌草性寒味苦甘，入胃、大腸、小腸經(jīng)。具清熱解毒、消炎止痛、利尿消腫、抗癌腫等功效[12]。據(jù)相關文獻記載，李明[13]通過研究多糖類化合物對游泳小鼠的抗疲勞作用，證實了白花蛇舌草多糖能顯著提高肌糖原和肝糖原的貯存，提高血清中SOD水平并降低MDA水平，顯著延長了游泳小鼠的游泳時間。此外其還具有體外抗氧化活性，并可延緩疲勞的發(fā)生，這一作用可能與其抑制過氧化損傷有關。于新等[14]采用現(xiàn)種不同溶劑提取白花蛇舌草中的成分，實驗表明這代種溶劑的提取物均具有抗氧化作用，其中以丙酮提取的氧化物抗氧化作用最強，該提取物可改變氧化態(tài)、酮式官能團及烯醇式官能團的化學特征，表現(xiàn)出了較強的抗氧化活性。

縱觀全方，補腎解毒方中六味地黃丸、冬蟲夏草、白花蛇舌草均有提高機體SOD水平降低MDA生成的抗氧化作用，本研究發(fā)現(xiàn)輻射可使正常機體MDA含量隨時間的推移呈進行性增高，SOD水平明顯降低。而經(jīng)補腎解毒方提前干預的機體MDA含量則在輻射后出現(xiàn)先明顯增高14 d后明顯降低的趨勢，且14 d后其含量與正常機體相差無幾，SOD水平也在14 d后得到明顯提高。這表明補腎解毒方能有效的提高機體抗氧化活性，降低過氧化產(chǎn)物生成，對機體的抗氧化能力有良好的干預作用，我觀察組將繼續(xù)深入此項研究，力求使其能盡早應用于人體，拓展中藥抗輻射、抗氧化方面的臨床應用。

參考文獻

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