許坤 辛怡純 陳懇 陸志俊

摘 要 目的：研究七氟烷對(duì)小鼠空間記憶能力和海馬組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶B（TrkB）表達(dá)的影響。方法：將54只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為麻醉組和對(duì)照組，每組27只。上述2組又分別分為麻醉后第1 d（第一階段）、第7 d（第二階段）、第28 d（第三階段）3個(gè)亞組，每亞組9只。麻醉組小鼠置于麻醉箱中，給予七氟烷（初始體積分?jǐn)?shù)為5%，維持1 min，后降至2.5%，維持120 min），完成麻醉后復(fù)蘇；對(duì)照組小鼠始終給予純氧。每階段均進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，每階段結(jié)束后分別采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定海馬組織中BDNF、TrkB mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，第一階段麻醉組小鼠平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；第二、三階段麻醉組小鼠平臺(tái)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3個(gè)階段中，麻醉組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB mRNA和蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：七氟烷麻醉可增強(qiáng)麻醉后早期小鼠空間記憶能力，且不影響其海馬組織中BDNF和TrkB的合成。

關(guān)鍵詞 七氟烷；小鼠；空間記憶；Morris水迷宮；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；酪氨酸激酶B

中圖分類號(hào) R338.64；R614.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1953-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.19

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of sevoflurane on spatial memory ability and expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） and tyrosine kinase B （TrkB） in hippocampus of mice. METHODS： A total of 54 C57BL/6 mice were randomly divided into anesthesia group and control group， with 27 rats in each group. Above 2 groups were divided into first day （first stage）， seventh day （second stage）， twenty-eighth day （third stage） sub-groups after anaesthesia， with 9 mice in each. In anesthesia group， mice were placed in a narcotic box， given sevoflurane 5% for 1 min and then decreased to 2.5% for 120 min； mice recoveried after anaesthesia completion. In control group， mice were always given pure oxygen. Morris water maze test was conducted in each stage. mRNA and protein expression levels of BDNF and TrkB in mice hippocampus were determined by PCR and ELISA after each stage. RESULTS： Compared with control group， platform quadrant and retention time of mice was prolonged significantly in first stage of anesthesia group， and the percentage of platform quadrant time was increased significantly， with statistical significance （P<0.05）， but there was no significant change in the times of crossing platform （P>0.05）. In second and third stage， there was no significant change in platform quadrant and retention time， the percentage of platform quadrant time or the times of crossing platform in anesthesia group （P>0.05）. There was no significant change in mRNA and protein expression levels of BNDF and TrkB in mice hippocampus of anesthesia group （P>0.05）. CONCLUSIONS： Sevoflurane anesthesia can strengthen spatial memory ability of mice in the early stage after anesthesia， but does not influence the generation of BDNF and TrkB in hippocampus.

KEYWORDS Sevoflurane； Mice； Spatial memory； Morris water maze； Brain-derived neurotrophic factor； Tyrosine kinase B

吸入麻醉藥能影響患者麻醉后的記憶能力，這也是引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）的主要原因之一[1-3]。七氟烷是臨床中廣泛應(yīng)用的吸入麻醉藥，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)臨床麻醉量的七氟烷能抑制小鼠對(duì)新事物的記憶能力[4]，這可能與海馬組織的記憶形成和儲(chǔ)存功能受到抑制有關(guān)[5]。而Alkire MT等[6]卻發(fā)現(xiàn)，在逃避抑制實(shí)驗(yàn)中七氟烷（0.11%）能顯著提高大鼠的恐懼記憶能力。

以往研究發(fā)現(xiàn)，全身麻醉藥物（異氟醚、咪唑安定等）具有誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用，進(jìn)而可抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，其原因與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）及其受體酪氨酸激酶B（TrkB）相關(guān)[7]。而B(niǎo)DNF是決定記憶能力的重要因素[8]，通過(guò)對(duì)基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，海馬組織中BDNF表達(dá)較低的小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中對(duì)平臺(tái)位置的記憶能力較弱[9]。七氟烷對(duì)記憶能力的影響是否亦與BDNF有關(guān)目前尚不清楚。鑒于此，本研究觀察了臨床麻醉量（2.5%）的七氟烷對(duì)小鼠空間記憶能力及其海馬組織中BDNF、TrkB表達(dá)的影響，以期為闡明七氟烷對(duì)記憶能力影響的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SpectraMax 190型微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)MD公司）；GZX-970MBE型電熱鼓風(fēng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；9700PCR型擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；Dolphin- Doc114102型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Wealtec公司）；Ultrospec2100型紫外分光光度儀（美國(guó)Amershan Bioscience公司）；DY602S型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（南京大學(xué)儀器廠）；DigBehv-MG型Morris水迷宮、Morris水迷宮動(dòng)物行為分析系統(tǒng)2.0版（上海吉量軟件科技有限公司）；QIAGEN TissuLyserⅡ型高通量組織研磨器（德國(guó)Retsch公司）。

1.2 藥品與試劑

七氟烷（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1001563）；小鼠BDNF 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)：EK0309100512）、小鼠TrkB ELISA試劑盒（批號(hào)：EK0849091152）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司； 鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（美國(guó)Promega公司）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量分析試劑盒[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：091150123]；TaqMan基因表達(dá)聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）MIX（批號(hào)：4369510_ml）、BDNF基因表達(dá)探針（批號(hào)：Mn01334042_ml）、TrkB基因表達(dá)探針（批號(hào)：Mn00435422_ml）、小鼠β-action內(nèi)參引物（批號(hào)：4352933E）均購(gòu)自美國(guó)ABI公司；二氧化鈦、戊巴比妥鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 動(dòng)物

C57BL/6小鼠54只，♂，9～10周齡，體質(zhì)量27～29 g，購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（蘇）2010-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2008-0001。小鼠飼養(yǎng)于22 ℃恒溫動(dòng)物房，每12 h光照與黑暗交替（光照時(shí)間7：00-19：00），自由飲水和飲食。期間應(yīng)避免小鼠受到異常驚擾而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

2 方法

2.1 分組與麻醉

將54只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為麻醉組和對(duì)照組，每組27只。上述兩組小鼠又分別分為麻醉后第1 d（第一階段）、第7 d（第二階段）、第28 d（第三階段）3個(gè)亞組，每亞組9只。麻醉組小鼠置于麻醉箱中，給予七氟烷（初始體積分?jǐn)?shù)為5%，維持1 min，后降至2.5%，維持120 min），完成麻醉后復(fù)蘇；對(duì)照組小鼠始終給予純氧。

2.2 小鼠空間記憶能力考察

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包含4 d訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和1 d探索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水槽為圓形，直徑122 cm，分為4個(gè)象限，在第Ⅱ象限中央設(shè)圓形平臺(tái)，直徑10 cm，以透明有機(jī)玻璃制成，位于水平面下0.8 cm左右，水中加入白色染料（二氧化鈦），水溫保持在22～24 ℃。在訓(xùn)練期間每只小鼠每天從4個(gè)不同起點(diǎn)入水訓(xùn)練4次，每次入水時(shí)間最長(zhǎng)不超過(guò)2 min，如果小鼠在2 min內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，則人為誘導(dǎo)小鼠到達(dá)平臺(tái)；每次訓(xùn)練完畢后均讓小鼠在平臺(tái)上停留15 s，以加深對(duì)空間線索的記憶。

末次水迷宮訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)。第Ⅱ象限的平臺(tái)被拆除，小鼠從一個(gè)新起點(diǎn)入水，對(duì)平臺(tái)位置進(jìn)行搜索。入水時(shí)間限定1 min，記錄小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間和平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比。

2.3 小鼠海馬組織中BDNF、TrkB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

每階段空間記憶能力考察結(jié)束后，小鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉250 μL進(jìn)行麻醉，去除顱骨，剝離海馬組織并于-80 ℃下保存，一半用于提取總RNA，另一半用于檢測(cè)BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平。 采用PCR法檢測(cè)小鼠海馬組織中BDNF、TrkB mRNA表達(dá)水平。取處于對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按1×107 L-1密度，每孔2.5 mL接種于6 孔板中，以Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin引物為內(nèi)參。PCR條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸5 min終止反應(yīng)。讀取循環(huán)閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的表達(dá)水平（-ΔΔCt計(jì)算公式：-ΔΔCt XY=Ct XY-Ct β-actinY-Ct X對(duì)照，其中X為基因，Y為處理因素）[10]。以BDNF/β-actin、TrkB/β-actin比值分別代表各自mRNA相對(duì)表達(dá)水平。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 小鼠海馬組織中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)小鼠海馬組織中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×107 L-1密度、每孔2.5 mL 接種于 6 孔板中。設(shè)置空白孔、待測(cè)樣品孔進(jìn)行加樣，溫育30 min，用30倍濃縮液稀釋后進(jìn)行洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑后再溫育30 min，重復(fù)洗滌后加入顯色劑顯色15 min，加入終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、OD 值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，根據(jù)回歸方程計(jì)算相應(yīng)濃度。采用BCA蛋白定量法檢測(cè)小鼠海馬組織中總蛋白含量，以每1 mg總蛋白中BDNF、TrkB蛋白含量分別代表各自蛋白相對(duì)表達(dá)水平。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 11.5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較；非參數(shù)資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物死亡情況

第一階段麻醉組有1只小鼠因死亡被剔除。

3.2 兩組小鼠空間記憶能力比較

第一階段，與對(duì)照組比較，麻醉組小鼠平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；穿越平臺(tái)次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第二、三階段，兩組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間、平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡圖見(jiàn)圖1；兩組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間和平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比比較見(jiàn)表1。

3.3 兩組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB mRNA表達(dá)水平比較

3個(gè)階段中，兩組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB mRNA表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表2。

3.4 兩組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平比較

3個(gè)階段中，兩組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表3。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七氟烷麻醉結(jié)束后早期（第一階段），小鼠對(duì)空間位置的記憶能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為麻醉組小鼠平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)和平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著升高。但是，七氟烷麻醉結(jié)束后的中后期（第二、三階段），麻醉組小鼠的空間記憶能力已經(jīng)恢復(fù)到正常水平。同時(shí)，七氟烷麻醉并不影響小鼠海馬組織中BDNF、TrkB的mRNA和蛋白表達(dá)。

全身麻醉可能引起患者術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙，主要涉及學(xué)習(xí)和記憶能力。吸入麻醉藥，包括安氟醚、異氟醚和七氟烷等，是全身麻醉中的主要候選藥品[11]，但它們對(duì)記憶能力的影響目前仍然有很大爭(zhēng)議。Culley DJ等[12]發(fā)現(xiàn)，在異氟醚麻醉結(jié)束后24 h對(duì)大鼠進(jìn)行12臂星形迷宮訓(xùn)練，大鼠的記憶能力顯著下降。而Komatsu H等[13]用安氟醚進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)時(shí)卻發(fā)現(xiàn)小鼠的記憶能力顯著提高。以上研究結(jié)果提示，不同的吸入麻醉藥對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響可能不同。七氟烷對(duì)記憶能力的影響，目前也沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。Wiklund A等[4]發(fā)現(xiàn)七氟烷（2.6%）能抑制小鼠對(duì)新事物的記憶能力。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇了臨床所用的麻醉量2.5%。本研究結(jié)論與上述文獻(xiàn)不同的可能原因?yàn)椋海?）七氟烷的用量不同；（2）所研究的記憶能力種類不同，不同類型的記憶能力與大腦不同部位的功能相關(guān)。

吸入麻醉藥對(duì)記憶能力的中遠(yuǎn)期影響是否存在，也尚無(wú)肯定的結(jié)論。以往研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷麻醉后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的記憶能力改變可能維持2個(gè)月[14]。而本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，七氟烷麻醉后第7 d和第28 d的小鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間記憶能力與對(duì)照組小鼠沒(méi)有顯著差異。這兩個(gè)研究中的吸入麻醉藥品種不同，可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因。此方面還需進(jìn)一步研究。

記憶的形成和儲(chǔ)存過(guò)程中BDNF起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BDNF基因敲除小鼠的海馬組織神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法形成長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)作電位（LTP），而給予外源性BDNF后，能恢復(fù)小鼠LTP[15]。TrkB是BDNF的受體，BDNF與TrkB結(jié)合后，可以增強(qiáng)興奮型神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的突觸傳遞，并上調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體數(shù)量，進(jìn)而調(diào)控記憶的形成和儲(chǔ)存[15]。記憶的長(zhǎng)期維持與記憶形成屬于兩個(gè)不同階段。以往研究認(rèn)為，海馬組織并不參與記憶的長(zhǎng)期維持，在海馬組織中形成的記憶將轉(zhuǎn)移至大腦皮層形成穩(wěn)定的記憶痕跡，使記憶能得到長(zhǎng)期維持[15]。但Bekinschtein P等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在逃避抑制實(shí)驗(yàn)中大鼠對(duì)恐懼記憶的長(zhǎng)期維持需要海馬組織BDNF的參與，這一階段大鼠海馬組織中BDNF mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，而抑制其BDNF的合成會(huì)干擾恐懼記憶的維持。

全身麻醉對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷可能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)[6-7]。作為一種常用的吸入麻醉藥，七氟烷對(duì)BDNF/TrkB系統(tǒng)的影響，目前還缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)首次觀察了七氟烷對(duì)小鼠BDNF/TrkB系統(tǒng)的影響。研究結(jié)果顯示，七氟烷麻醉結(jié)束后，無(wú)論早期還是中后期，BDNF、TrkB蛋白表達(dá)水平均未顯著改變。這說(shuō)明，七氟烷對(duì)小鼠的記憶增強(qiáng)作用與海馬組織中BDNF、TrkB的合成無(wú)關(guān)，可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用。學(xué)習(xí)和記憶能力不僅受到BDNF/TrkB系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，還與膽堿能受體和去甲腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)[17-18]。吸入麻醉藥能增加去甲腎上腺素的基礎(chǔ)釋放量[19]，而去甲腎上腺素可能參與乙酰膽堿對(duì)LTP和突觸可塑性的調(diào)節(jié)機(jī)制。Murai T等[20]發(fā)現(xiàn)，毒蕈堿樣乙酰膽堿受體抑制劑（1 mg/kg）能降低CD1小鼠對(duì)物體位置的記憶能力，而膽堿酯酶抑制劑（3 mg/kg）則能顯著提高CD1小鼠對(duì)物體位置的記憶能力。其機(jī)制可能與乙酰膽堿引起的去甲腎上腺素釋放有關(guān)。還有研究表明，刺激海馬組織的乙酰膽堿受體能引起去甲腎上腺素釋放增加，并增強(qiáng)LTP[21]。此外，麻醉時(shí)的腦內(nèi)某些離子通道的變化與睡眠時(shí)十分接近[22]，因此，麻醉組小鼠在水迷宮訓(xùn)練前有過(guò)一個(gè)良好的睡眠過(guò)程，這也可能改善其神經(jīng)細(xì)胞的記憶能力[23]。這些原因是否與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有關(guān)，仍有待更深入的研究。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)仍有局限。臨床全身麻醉以復(fù)合麻醉（多種藥物聯(lián)合應(yīng)用）為主，一般不會(huì)僅使用七氟烷，因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能全面反映臨床麻醉的實(shí)際情況。為更好地了解全身麻醉與POCD發(fā)生的關(guān)系，還需要一個(gè)設(shè)計(jì)良好的大樣本臨床研究進(jìn)一步揭示。

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（收稿日期：2017-11-19 修回日期：2018-02-18）

（編輯：張 靜）