王艷紅，任秋霞，趙慶國(guó)（解放軍302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039）

替考拉寧（teicoplanin，TEC）是一種新型糖肽類抗生素，由5個(gè)結(jié)構(gòu)相似的化合物TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組分較多含10或11個(gè)碳的脂肪鏈，其中TA2-2為主要成分，占各組分相對(duì)含量的40%以上[1]。測(cè)定替考拉寧谷濃度可為其在臨床的合理應(yīng)用提供方法學(xué)依據(jù)，其血藥谷濃度可反映給藥間隔期間藥物暴露量是否高于細(xì)菌的MIC與持續(xù)時(shí)間，當(dāng)AUC/MIC≥345 時(shí)，可達(dá)到最佳治療效果[2]。研究表明[3]，一般感染的患者替考拉寧的谷濃度應(yīng)＞ 10 mg·L-1，重度感染時(shí)應(yīng)保持在15 mg·L-1以上；血流感染、重癥肺炎及感染性心內(nèi)膜炎等替考拉寧血藥谷濃度應(yīng)維持在20 mg·L-1或更高。但由于替考拉寧成分復(fù)雜、半衰期較長(zhǎng)，患者在常規(guī)劑量使用過程中低于目標(biāo)治療谷濃度的發(fā)生率較高。同時(shí)，替考拉寧在我國(guó)臨床實(shí)際應(yīng)用中普遍存在忽視起始負(fù)荷劑量或起始負(fù)荷劑量及維持劑量偏低的現(xiàn)象。因此，在臨床使用過程中對(duì)替考拉寧血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)是非常必要的。

文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)替考拉寧血藥濃度測(cè)定的方法主要是HPLC分析法，包括HPLC-UV檢測(cè)法[4-5]、LCMS/MS檢測(cè)法[6]和藥典中刊載的梯度洗脫的反相HPLC檢測(cè)法。本研究建立的UPLC紫外檢測(cè)法采用了超高壓系統(tǒng)和小粒徑填料色譜柱，具有分離時(shí)間短、分離效率高、更加靈敏和節(jié)省試劑等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，適用于臨床替考拉寧血藥濃度檢測(cè)。

1 儀器與試藥

Agilent 1290型超高壓液相色譜系統(tǒng)，包括G4212A型DAD檢測(cè)器、G4220A型二元輸液泵、G4226A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C型柱溫箱和化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；QB-600型高速振蕩混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-16C型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（純度：1 mg相當(dāng)于894 U，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130374-201002），甲醇、乙腈、三氯甲烷均為色譜純，三氟乙酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；保護(hù)住Zorbax SB-C18柱（2.1 mm×5 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.1% TFA）（24.2 : 75.8，v/ v）；流速：0.4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品約50.02 mg，精密稱定，用30%甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得5.02 mg·mL-1替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用純化水稀釋成100、400、800 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取血漿樣品200 μL于1.5 mL的Ep管中，首先加入10 μL 10%高氯酸渦旋震蕩10 s，然后加入乙腈400 μL，渦旋振蕩5 min，11000 r·min-1離心5 min，取上清液400 μL至另一Ep管中，加入萃取劑三氯甲烷400 μL渦旋振蕩5 min，11000 r·min-1離心5 min，取上清液100 μL至另一Ep管中，離心后取上清液5.0 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法的專屬性

分別取空白血漿、空白血漿+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品及患者血漿溶液200 μL，按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾血漿中替考拉寧的分析。同時(shí)，我們還考察了5例臨床患者血漿（未用替考拉寧）+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)情況，結(jié)果表明未用替考拉寧的臨床患者血漿內(nèi)雜質(zhì)及藥物均不干擾替考拉寧的分析。替考拉寧各組分保留時(shí)間分別為3.2 min、4.4 min、5.2 min、8.9 min和9.9 min，理論塔板數(shù)按替考拉寧計(jì)算大于9500。如圖1所示本法具有較高的專屬性。

圖1 高效液相色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（30 μg·mL-1），C – 患者血漿，D – 臨床患者血漿（未用替考拉寧）+替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品（30 μg·mL-1）；1 – TA2-1，2 – TA2-2，3 – TA2-3，4 – TA2-4，5 – TA2-5Fig 1 The UPLC chromatogramsA – blank plasma; B – blank plasma + teicoplanin standard (30 μg·mL-1); C – patient plasma, D – clinical patient plasma (not used teicoplanin) + teicoplanin standard (30 μg·mL-1); 1 – TA2-1, 2 – TA2-2,3 – TA2-3, 4 – TA2-4, 5 – TA2-5

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取不同濃度的替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，加入健康人空白血漿200 μL，混勻，制成相當(dāng)于替考拉寧濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg·mL-1的血漿樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析。以替考拉寧各組分面積（A）和對(duì)替考拉寧血漿濃度（C）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A= 68.85C+ 54.44（R2= 0.9998，n= 3）。結(jié)果表明，替考拉寧血藥濃度在2.0 ～ 80.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.65 μg·mL-1。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法配制5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個(gè)濃度的替考拉寧血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，測(cè)得替考拉寧峰面積之和與用純化水配制的相應(yīng)濃度替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品所得的峰面積之和進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率；根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度，與理論濃度進(jìn)行比較得出方法回收率，結(jié)果見表1。

表1 血漿中替考拉寧的回收率和精密度. n = 5Tab 1 Recovery and precision of teicoplanin in plasma. n = 5

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取配制的5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個(gè)濃度的替考拉寧血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度平行5份，重復(fù)測(cè)定三批（共計(jì)45份），計(jì)算批內(nèi)和批間RSD，結(jié)果如表1所示。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法配制5.0、30.0、70.0 μg·mL-1低、中、高3個(gè)濃度的替考拉寧血漿樣品，每個(gè)濃度平行27份，取3個(gè)濃度各3份按“2.3”項(xiàng)下方法立即處理，進(jìn)樣分析；剩余樣品每個(gè)濃度各3份在室溫放置4 h、4 ℃冰箱冷藏24 h、進(jìn)樣器放置24 h、– 80 ℃冰箱冷凍30 d、60 d、90 d、反復(fù)凍融2次、3次后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，UPLC進(jìn)樣分析，分別以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中藥物濃度。結(jié)果表明，血漿中替考拉寧在常溫放置4 h、4 ℃冰箱冷藏24 h、進(jìn)樣器放置24 h、反復(fù)凍融3次、– 80 ℃冰箱冷凍60 d條件下均保持穩(wěn)定，詳見表2。

2.9 臨床應(yīng)用

14例患者均采用靜脈給藥，采血時(shí)間是在給予負(fù)荷劑量3 ～ 4次，維持劑量2 ～ 3次后，下一次給藥前抽取靜脈血，為患者谷濃度血樣（肝素抗凝）。樣本3500 r·min-1離心5 min，取血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，測(cè)得替考拉寧血藥濃度，詳見表3。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 5Tab 2 The results of stability test. n = 5

表3 受試者血藥濃度測(cè)定結(jié)果Tab 3 Measurement results of plasma drug concentration in patients

3 討論

3.1 流動(dòng)相體系的選擇

本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)乙腈-磷酸緩沖鹽體系進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以磷酸鹽緩沖體系作為流動(dòng)相，色譜柱柱壓較高，色譜柱易堵塞，樣品分析后需對(duì)儀器進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的清洗，工作繁瑣。于是我們對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，考察了酸性的乙腈-水（含TFA）體系不同配比對(duì)替考拉寧5個(gè)主要成分的容量因子和分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加乙腈比例可縮短保留時(shí)間，適當(dāng)增加三氟乙酸的含量可提高替考拉寧各組分的峰面積，消除拖尾。當(dāng)乙腈-水（含0.1% TFA）（24.2 : 75.8）時(shí)，替考拉寧各組分容量因子適宜，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間在10 min內(nèi)。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的替考拉寧測(cè)定方法多為內(nèi)標(biāo)法。按照文獻(xiàn)報(bào)道的條件，我們分別以哌拉西林鈉和青霉素鈉為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了考察，但最終發(fā)現(xiàn)無論以磷酸鹽作為流動(dòng)相還是以三氟乙酸為流動(dòng)相內(nèi)標(biāo)均不穩(wěn)定，進(jìn)樣器放置2 h、4 h，哌拉西林鈉峰面積分別降解為原來的87.8%和79.5%。同時(shí)，青霉素和哌拉西林均為臨床常用藥，以此為內(nèi)標(biāo)易出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)受干擾現(xiàn)象。鑒于此，我們選擇用外標(biāo)法對(duì)替考拉寧進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 樣品處理方法的選擇

單純采用乙腈沉淀蛋白法對(duì)樣品進(jìn)行處理, 內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，峰形不對(duì)稱，易對(duì)小粒徑填料色譜柱造成阻塞，難以滿足血藥濃度監(jiān)測(cè)的要求。結(jié)合三氯甲烷提取對(duì)樣品進(jìn)行處理，可將大量雜質(zhì)萃取到有機(jī)相中，使樣品純化，組份濃集，但仍存在部分內(nèi)源性物質(zhì)干擾現(xiàn)象。為進(jìn)一步消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾，我們利用10%高氯酸加乙腈雙重沉淀蛋白，然后再結(jié)合三氯甲烷萃取的方法有效避免了內(nèi)源性物質(zhì)干擾現(xiàn)象。

3.4 患者測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的14例患者谷濃度差異顯著，14例患者中有4例（序號(hào)3、4、8、9）患者谷濃度低于說明書中建議的有效濃度。替考拉寧耐受性良好，但谷濃度過低易誘發(fā)細(xì)菌耐藥，導(dǎo)致感染控制不佳，進(jìn)而延長(zhǎng)患者的治療時(shí)間。Wang等[7]研究表明，替考拉寧是時(shí)間依賴性抗菌藥物，其抗菌療效和谷濃度密切相關(guān)。因此，我們應(yīng)密切關(guān)注患者替考拉寧的血藥濃度，通過監(jiān)測(cè)其谷濃度及時(shí)調(diào)整用藥方案以實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化給藥，保證替考拉寧的臨床療效，減少耐藥的發(fā)生率。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立的替考拉寧血藥濃度的測(cè)定方法靈敏、準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，回收率較高，可用于臨床替考拉寧血藥濃度的測(cè)定，同時(shí)對(duì)替考拉寧給藥方案的調(diào)整，臨床實(shí)施個(gè)體化治療，確保用藥安全、有效有一定的指導(dǎo)作用。