何琳琳

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 維生素D生理與應(yīng)用研究所， 陜西 漢中 723000)

干細(xì)胞(stem cell, SC)是來自胚胎、胎兒或成體內(nèi)，具有無限自我更新和增殖能力以及不同程度分化潛能的一類細(xì)胞。根據(jù)來源分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)、成體干細(xì)胞(adult stem cell, ASC)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)屬于ASC，是一類存在于已分化組織骨髓中的未分化細(xì)胞，正常情況下處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)或在外因誘導(dǎo)下可以表現(xiàn)出不同程度的分化潛能和自我更新能力。BM-MSCs在骨髓中數(shù)量很少，然而在體外易于培養(yǎng)和擴(kuò)增，可分化成為多種類型的細(xì)胞，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床應(yīng)用研究。目前哺乳動物BM-MSCs的研究較多，如人、大鼠、小鼠、豬、山羊等[1-5]，然而禽類BM-MSCs研究相對較少。本文對禽類BM-MSCs的來源、分離純化、表面標(biāo)志物及多向分化潛能的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 禽類BM-MSCs的來源

禽類BM-MSCs的來源主要是雞，如海蘭雞、羅曼鶴雞、北京油雞、Raf雞、Hiline雞、土耳其代尼茲利雞、肉雞Ross 308，包括出生后的雞和雞胚期的骨髓，出生后的雞包括1～60 d的雞，其次從鴨的骨髓中也分離到BM-MSCs。自從2009年Khatri M等[6]首次從1～14 d雞股骨骨髓分離出BM-MSCs之后，陸續(xù)從出生后的雞和鴨骨髓中分離獲得BM-MSCs，如1～10 d海蘭雞股骨和脛骨[7]、1～14 d羅曼鶴雞股骨和脛骨[8]、30～60 d北京油雞脛骨[9]、2～5 d雞股骨和脛骨[10]、3～25 d的Raf雞和Hiline雞[11]、15 d Raf雞股骨和脛骨[12]、1 d鴨脛骨[13]等的骨髓。同時從雞胚期的骨髓也可分離得到BM-MSCs，如受精后20 d的海蘭褐雞胚股骨骨髓[14]、20 d齡土耳其代尼茲利公雞胚脛骨和股骨骨髓[15]、產(chǎn)前13 d雞胚股骨骨髓[16]、來自商業(yè)用途的肉雞Ross 308、海蘭蛋雞和SPF蛋雞19 d齡雞胚股骨骨髓[17]。因此，禽類BM-MSCs已從雞胚、雞或鴨的骨髓分離獲得，其它禽類BM-MSCs目前尚無報道。

2 禽類BM-MSCs的分離純化

BM-MSCs在組織中含量低，要獲得大量活性好和分化能力高的禽類BM-MSCs，分離純化方法至關(guān)重要。禽類BM-MSCs的分離純化方法包括全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法。全骨髓貼壁法利用BM-MSCs貼壁生長的特性，只需將吹散的骨髓細(xì)胞懸液種植在培養(yǎng)皿里培養(yǎng)即可，而密度梯度離心法應(yīng)用市售的密度梯度離心介質(zhì)Ficoll-Paque或Percoll-Paque，將骨髓中的單核細(xì)胞富集后，再利用BM-MSCs貼壁生長的特性，從單核細(xì)胞中分離BM-MSCs。貼壁培養(yǎng)法是指將細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行培養(yǎng)的方法。一般分離骨髓來源的禽類BM-MSCs采用全骨髓貼壁法，通過換液去除未貼壁的懸浮細(xì)胞，再通過傳代進(jìn)行純化，目前采用這種方法已從海蘭雞[7]、羅曼鶴雞[8]、北京油雞[9]、土耳其代尼茲利公雞胚[15]、未標(biāo)明品種的雞[10]和雞胚[16]的骨髓分離得到BM-MSCs。還可采用密度梯度離心法分離，將吹打散的雞骨髓細(xì)胞用Ficoll-Paque離心后，將單核細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿[6,13,17]或者明膠包被的培養(yǎng)皿[14]，使其貼壁培養(yǎng)后分離純化得到BM-MSCs。

3 禽類BM-MSCs的表面標(biāo)志物

不同禽類來源BM-MSCs表面標(biāo)志物表達(dá)與否不盡相同。來自未標(biāo)明品種的雞BM-MSCs表型是CD44、CD90、CD105陽性和CD45陰性，表達(dá)多能性標(biāo)志物基因PouV、Sox2和Nanog[6]；海蘭雞BM-MSCs為干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-3和SSEA-4陽性[7]；羅曼鶴雞骨髓BM-MSCs表型是CD29陽性和CD34陰性[8]；北京油雞骨髓BM-MSCs表型是CD29、CD44、CD71、CD73陽性和CD31、CD34陰性[9]；2～5 d雞骨髓分離BM-MSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD44、CD90、CD105陽性，造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31陰性[10]；鴨BM-MSCs表達(dá)表面抗原CD44、ICAM-1和SSEA-4，不表達(dá)表面抗原CD34、CD45和SSEA-1[13]；海蘭褐雞胚骨髓BM-MSCs為CD44、CD90和CD105陽性[14]；土耳其代尼茲利公雞雞胚骨髓BM-MSCs表達(dá)非造血骨髓祖細(xì)胞的標(biāo)志STRO-1、CD105和CD73[15]；雞胚骨髓BM-MSCs為CD44、CD73、vimentin、CD90和CD105陽性，CD45和CD34陰性，表達(dá)多能性標(biāo)志物蛋白Oct4、Sox2，表達(dá)多能性標(biāo)志物基因Oct4、Sox2和Nanog[16]?？梢?，出生后雞和鴨以及雞胚BM-MSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD44、CD90、CD105、CD29、CD71、CD73、vimentin陽性[6,8-10,13-16]，造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45、CD34、STRO-1、CD73陰性[6,8-10,13,15,16]，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31[9]；海蘭雞和鴨BM-MSCs均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-4[7,13]，海蘭雞BM-MSCs還表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-3[7]，而鴨BM-MSCs不表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SSEA-1[13]；雞BM-MSCs還表達(dá)多能性標(biāo)志物基因PouV、Sox2、Nanog和Oct4[6,16]。

表1 禽類BM-MSCs的多向分化潛能

4 禽類BM-MSCs的多向分化潛能

骨髓來源的BM-MSCs具有多向分化潛能，可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、雄性生殖細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞方向分化，還可分化成為精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSC)(如表1所示)。如雞BM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后表達(dá)基因Osteopontin，Von Kossa染色有礦化骨節(jié)形成，成脂誘導(dǎo)后表達(dá)基因PPARγ和aP2，油紅O染色有脂滴生成，成軟骨誘導(dǎo)后表達(dá)基因CollagenⅡ，阿爾新藍(lán)染色有蛋白聚糖形成，表明其具有成骨、成脂、成軟骨分化潛能[6]；海蘭雞BM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色有堿性磷酸酶陽性細(xì)胞，茜素紅染色有礦化骨節(jié)形成，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色有脂滴生成，證明其具有成骨和成脂分化潛能，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子還可促使其向SSC分化[7]；羅曼鶴雞BM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色有礦化骨節(jié)形成，成脂誘導(dǎo)后油紅O染色有脂滴生成，表明其具有成骨和成脂分化潛能[8]；北京油雞BM-MSCs經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)，分別用茜素紅染色、油紅O染色后顯示有礦化骨節(jié)形成和脂滴生成，經(jīng)成內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)后顯示典型的“鵝卵石”樣形狀，表達(dá)象征性的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物基因和蛋白KDR和CD31，也表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物基因CD34，表明其具有成骨、成脂、成內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能[9]；Raf雞BM-MSCs經(jīng)成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)，茜素紅染色、阿爾新藍(lán)染色和油紅O染色分別顯示礦化骨節(jié)形成、蛋白聚糖形成和脂滴生成，表明其具有分化成為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的潛能[12]；鴨BM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅和Von Kossa染色有礦化骨節(jié)形成，成神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)后，呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)基因Nestin、NSE和GFAP，表明其具有成骨和成神經(jīng)細(xì)胞分化潛能[13]；海蘭褐雞胚股骨BM-MSCs在體外經(jīng)維甲酸和雞睪丸提取物誘導(dǎo)可分化成為雄性生殖細(xì)胞[14]；土耳其代尼茲利公雞胚BM-MSCs經(jīng)成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)，分別用茜素紅、油紅O、阿爾新藍(lán)染色后顯示有礦化骨節(jié)形成、脂滴生成和蛋白聚糖形成，表明其具有成骨、成脂、成軟骨分化潛能[15]；雞胚BM-MSCs經(jīng)成骨、成脂、成肝細(xì)胞、成胰島細(xì)胞誘導(dǎo)，分別用Von Kossa、油紅O、希氏高碘酸染色、DTZ染色、阿爾新藍(lán)染色后顯示有礦化骨節(jié)形成、脂滴生成、有糖原儲存、有β細(xì)胞產(chǎn)生，經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)有神經(jīng)元特異性標(biāo)記物β-3微管蛋白表達(dá)，經(jīng)心肌細(xì)胞誘導(dǎo)有心臟特異性標(biāo)志物蛋白如細(xì)胞骨架標(biāo)記Troponin I和核標(biāo)記物GATA4表達(dá)，表明其具有成骨、成脂、成肝細(xì)胞、成胰島細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、成心肌細(xì)胞方向的分化潛能[16]；羅斯308肉雞、海蘭蛋雞和無特定病原體(specefic pathogen free, SPF)蛋雞BM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色有礦化骨節(jié)形成，表明其具有成骨分化潛能[17]。可見禽類BM-MSCs多向分化潛能中檢測最多的是其成骨細(xì)胞分化潛能，其次是成脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化潛能，其他方向的分化潛能檢測較少。

5 總結(jié)和展望

目前已從不同禽類如海蘭雞、羅曼鶴雞、北京油雞、Raf雞、Hiline雞、土耳其代尼茲利雞、肉雞Ross 308和鴨的骨髓分離得到BM-MSCs，今后還可以進(jìn)一步擴(kuò)大禽類BM-MSCs的禽類來源，如漢中地理標(biāo)志產(chǎn)品略陽烏雞以及我國知名的一些禽類。目前，禽類BM-MSCs分離純化方法相對較少，它包括全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)法，這些方法可單獨使用，也可組合使用。除了采用上述3種方法之外，哺乳動物BM-MSCs的分離純化還采用免疫磁珠法[18]和流式細(xì)胞儀熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting, FACS)技術(shù)[19]，兩種方法都是基于已明確的表面標(biāo)志物表達(dá)與否進(jìn)行分離純化。然而，由于禽類BM-MSCs表面標(biāo)志物沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)定，目前沒有明確的純化用表面標(biāo)志物，因此其分離純化還未涉及上述兩種方法。不同禽類來源的BM-MSCs表面標(biāo)志物表達(dá)與否不盡相同。禽類BM-MSCs具有多向分化潛能，可向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、雄性生殖細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞方向進(jìn)行分化，還可分化為SSC。目前禽類BM-MSCs的橫向分化是當(dāng)前研究的熱點，隨著研究的不斷開展，將會發(fā)現(xiàn)更多禽類來源BM-MSCs的分化潛能。但是由于BM-MSCs禽類品種、年齡、胚胎期、分離方法等的不同，分離獲得的BM-MSCs在表面標(biāo)志物和分化潛能方面存在差異，新的禽類BM-MSCs表面標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)亟待建立。相信隨著禽類BM-MSCs來源的擴(kuò)展，分離方法、生物學(xué)特征和分化潛能研究的不斷深入，必將為禽類發(fā)育生物學(xué)及其用于再生醫(yī)學(xué)的研究帶來新的前景和希望。

[責(zé)任編輯：李 莉]