山溪 秦文斌 張振超 姚悅梅 肖燕 戴忠良

摘要：【目的】分析低溫（4 ℃）脅迫下甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）幼葉中還原型抗壞血酸—還原型谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)代謝的變化，為選育和推廣抗寒甘藍(lán)品種提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?個(gè)不同耐寒性甘藍(lán)品系為試驗(yàn)材料，測(cè)定分析低溫脅迫下其過(guò)氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）、AsA、GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、氧化型抗壞血酸（DHA）含量和AsA/DHA、GSH/GSSG及抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）活性的變化情況?！窘Y(jié)果】隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系幼葉的H2O2和MDA含量均明顯增加;耐寒甘藍(lán)品系231和235的AsA、GSH和GSSG含量顯著增加（P<0.05，下同），不耐寒甘藍(lán)品系161和163的AsA、GSH和GSSG含量則呈先增加后減少的變化趨勢(shì);DHA含量均呈增加趨勢(shì)，AsA/DHA和GSH/GSSG均呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，但不同耐寒性甘藍(lán)品系間存在差異;AsA-GSH循環(huán)中的APX、GR和MDAR活性在低溫脅迫期間均呈上升趨勢(shì)，而脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)?！窘Y(jié)論】耐寒甘藍(lán)品系231和235能更迅速響應(yīng)低溫脅迫，可有效清除H2O2，減輕氧化應(yīng)激損傷，維持甘藍(lán)體內(nèi)的氧化還原平衡。

關(guān)鍵詞： 甘藍(lán);低溫脅迫;AsA-GSH循環(huán);生理生化指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S635.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）11-2230-06

Effects of low temperature stress on leaf AsA-GSH cycle metabolism in different varieties Brassica oleracea L.

SHAN Xi， QIN Wen-bin， ZHANG Zhen-chao， YAO Yue-mei，

XIAO Yan， DAI Zhong-liang*

（Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area， Jurong， Jiangsu? 212400， China）

Abstract：【Objective】This study was undertaken to investigate the effects of low temperature stress（4 ℃） on the reduced ascorbic acid -glutathione（AsA-GSH） cycle metabolism in leaves of cabbage seedlings and provide reference for breeding and improving cold resistant cabbage varieties. 【Method】Under low temperature stress，variations of hydrogen peroxide（H2O2） content，malondialdehyde（MDA） content，AsA content，GSH content，glutathione disulfide（GSSG） content，dehydroascorbic acid（DHA） content，AsA/GSH ratio，GSH/GSSG ratio，ascorbate peroxidase（APX） activity，glutathione reductase（GR） activity，monodehydroascorbate reductase（MDAR） activity were determined on four cold resistant cabbage lines. 【Result】As low temperature stress time expanded， H2O2 and MDA contents in leaves of four cabbage lines increased largely， the contents of AsA，GSH and GSSG in cold-resistant cabbage lines（231 and 235） showed a significant increasing trend（P<0.05，the same below）. While the contents of AsA，GSH and GSSG in cold-sensitive lines（161 and 163） increased first，and then decreased. The DHA content in the four lines increased.? The AsA/GSH ratio and GSH/GSSG ratio increased first，and then decreased，but difference existed between different cold resistant lines. Activities of APX，GR and MDAR presented increasing trend in AsA-GSH cycle under low temperature stress， but dehydroascorbate reductase（DHAR） activity increased first，and then reduced. 【Conclusion】Cold resistant lines 231 and 235 can respond to low temperature stress quickly， eliminate H2O2 effectively， mitigate oxidative injury， and maintain redox equilibrium in cabbage.

Key words： cabbage; low temperature stress; AsA-GSH cycle; physiological and biochemical index

0 引言

【研究意義】甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）是我國(guó)各地廣泛栽培的蔬菜品種，常年種植面積約90萬(wàn)ha（楊麗梅等，2011），但冬季低溫常影響其幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)植株造成氧化傷害，致使產(chǎn)量和品質(zhì)降低。還原型抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）屬非酶抗氧化劑，與抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶構(gòu)成的AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)能有效清除低溫脅迫產(chǎn)生的自由基（Foyer and Noctor，2011），但至今對(duì)低溫脅迫下不同品系甘藍(lán)幼苗AsA-GSH循環(huán)代謝的抗氧化機(jī)制尚不清楚。因此，探討低溫脅迫對(duì)甘藍(lán)幼苗AsA-GSH循環(huán)代謝的影響，對(duì)選育推廣耐寒甘藍(lán)品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Tibor等（2003）、Esen等（2006）研究認(rèn)為，植物在正常生長(zhǎng)條件下可通過(guò)酶和非酶抗氧化劑的聯(lián)合作用清除其體內(nèi)多余的活性氧（ROS），包括超氧陰離子自由基（ ）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（·OH）等，維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平（韓一林等，2018;溫澤林等，2018），而低溫會(huì)引起ROS積累并對(duì)植物產(chǎn)生傷害。Ruelland和Zachowski（2010）、Matteucci等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可使植物萎蔫、萎黃或壞死，同時(shí)植株的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和膜脂組成發(fā)生變化、細(xì)胞電解質(zhì)和氨基酸泄露、原生質(zhì)流向改變、細(xì)胞鈣離子再分布、蛋白質(zhì)含量和酶活性改變。Foyer和Noctor（2011）研究認(rèn)為，AsA-GSH循環(huán)中的4種酶主要為APX、MDAR、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和GR，其中APX對(duì)H2O2的清除需在MDAR、DHAR和GR輔助下完成，AsA和GSH作為清除H2O2的還原底物，最終再生為三磷酸腺苷和鹽堿腺嘌呤二核苷酸進(jìn)行再循環(huán)。付晴晴等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，GR是維持AsA-GSH循環(huán)運(yùn)行的關(guān)鍵酶，能利用還原型輔酶II（NADPH）的電子將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成GSH，使植株細(xì)胞內(nèi)GSH庫(kù)能維持還原狀態(tài)。【本研究切入點(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于低溫脅迫對(duì)不同品系甘藍(lán)幼苗AsA-GSH循環(huán)代謝影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探討低溫脅迫對(duì)甘藍(lán)幼苗抗氧化酶和非酶抗氧化劑的影響，探究其植株抵御低溫脅迫的抗氧化機(jī)制，為選育耐寒甘藍(lán)品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試耐寒甘藍(lán)品系231、235和不耐寒甘藍(lán)品系161、163均由江蘇省鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所蔬菜花卉研究室提供。選取其飽滿種子播于營(yíng)養(yǎng)缽中，發(fā)芽后適時(shí)澆灌營(yíng)養(yǎng)液以確保植株正常生長(zhǎng)。待植株長(zhǎng)至4葉1心時(shí)，選取整齊一致的植株進(jìn)行低溫脅迫處理。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將4個(gè)甘藍(lán)品系幼苗放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行4 ℃低溫脅迫，其他生長(zhǎng)條件不變，分別于處理1、3和5 d時(shí)取樣，剪取幼苗葉片于-80 ℃保存，以備后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定使用。

1. 2. 2 測(cè)定指標(biāo)及方法 H2O2含量參照鄒琦（2001）的方法進(jìn)行測(cè)定，丙二醛（MDA）含量參照湯章城（2004）的方法進(jìn)行測(cè)定，AsA和總抗壞血酸氧化型抗壞血酸（AsA+DHA）含量參照Costa等（2002）的方法進(jìn)行測(cè)定，GSSG和總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量參照Nogalakshmi（2001）的方法進(jìn)行測(cè)定，APX和GR活性參照魏國(guó)芹等（2017）的方法進(jìn)行測(cè)定，DHAR和MDAR活性參照宋松泉等（2005）的方法進(jìn)行測(cè)定。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析、綜合性分析和制圖，以Duncan's進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 低溫脅迫對(duì)甘藍(lán)品系幼葉H2O2和MDA含量的影響

從圖1-A可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系幼苗的H2O2含量均呈顯著增加趨勢(shì)（P<0.05，下同）;品系161和163在低溫脅迫1～5 d的H2O2含量均明顯高于品系231和235。說(shuō)明低溫脅迫下，不耐寒甘藍(lán)品系幼葉中積累了過(guò)量的H2O2，可能對(duì)其植株產(chǎn)生氧化傷害。

從圖1-B可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，品系231和235的MDA含量顯著增加，但在同一低溫脅迫時(shí)間下品系231和235的MDA含量明顯低于品系161和163;品系161和163的MDA含量也隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但其低溫脅迫3和5 d時(shí)的MDA含量差異不顯著（P>0.05，下同）。說(shuō)明甘藍(lán)幼苗經(jīng)低溫脅迫后，其體內(nèi)的MDA含量發(fā)生了明顯變化，其中耐寒品系可通過(guò)自身的調(diào)節(jié)減少植株體內(nèi)MDA生成，從而增強(qiáng)其抵御低溫脅迫的耐性。

2. 2 低溫脅迫對(duì)甘藍(lán)品系幼葉非酶抗氧化劑含量的影響

從圖2-A可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，品系231和235的AsA含量顯著增加，且在同一低溫脅迫時(shí)間下品系231和235的AsA含量明顯高于品系161和163;品系161和163的AsA含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，其中，低溫脅迫3 d時(shí)AsA含量顯著高于低溫脅迫1 d時(shí)，與低溫脅迫5 d時(shí)差異不顯著;在低溫脅迫的1～5 d，品系231與235、品系161與163的AsA含量差異不明顯，但品系231和235的AsA含量明顯高于品系161和163。說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系能迅速響應(yīng)低溫脅迫產(chǎn)生AsA并維持較高水平以清除植株體內(nèi)的ROS。

從圖2-B可看出，4個(gè)甘藍(lán)品系幼葉的總AsA含量在低溫脅迫期間均顯著增加，其中品系231和235的總AsA含量明顯高于品系161與163，說(shuō)明在低溫脅迫下耐寒甘藍(lán)品系的DHA含量會(huì)迅速增加，從而維持較高含量的總AsA。從圖2-C可看出，低溫脅迫期間4個(gè)甘藍(lán)品系幼葉的DHA含量均呈不同程度增加趨勢(shì)，其中品系231和235在低溫脅迫3 d時(shí)的DHA含量與低溫脅迫1 d時(shí)差異不顯著，低溫脅迫5 d時(shí)則顯著增加，而品系161和163的DHA含量在低溫脅迫期間均顯著增加，說(shuō)明低溫脅迫后期甘藍(lán)幼葉中的AsA被H2O2自由基氧化生成DHA并大量積累。

從圖2-D可看出，低溫脅迫1 d時(shí)，品系231和235的AsA/DHA明顯高于品系161和163;低溫脅迫3 d時(shí)，4個(gè)品系的AsA/DHA均達(dá)最高值，其中品系235的AsA/DHA明顯高于品系231、161和163。說(shuō)明在低溫脅迫期間，耐寒品系235的植株可利用其體內(nèi)較高水平的AsA來(lái)維持氧化還原平衡，耐低溫脅迫能力更強(qiáng)。

從圖3-A可看出，在低溫脅迫的1～5 d，品系231和235的GSH含量呈顯著增加趨勢(shì)，且均明顯高于品系161和163;品系161和163的GSH含量在低溫脅迫3 d時(shí)達(dá)最大值，且顯著高于低溫脅迫1 d時(shí)，但與低溫脅迫5 d時(shí)的差異不顯著;各品系GSSG和GSH+GSSG含量的變化趨勢(shì)與GSH相似（圖3-B和圖3-C）。說(shuō)明在低溫脅迫期間，耐低溫甘藍(lán)品系除可通過(guò)AsA清除ROS外，還可通過(guò)GSH來(lái)維持植株體內(nèi)的氧化還原平衡。

從圖3-D可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系的GSH/GSSG均呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，而低溫脅迫1 d時(shí)品系231和235的GSH/GSSG明顯高于品系161和163，說(shuō)明低溫脅迫初期耐寒甘藍(lán)品系能迅速響應(yīng)低溫脅迫調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原狀態(tài);低溫脅迫3 d時(shí)，4個(gè)甘藍(lán)品系的GSH/GSSG均顯著增加，其中品系231和235的GSH/GSSG明顯高于品系161和163，說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系植株對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)性反應(yīng)強(qiáng)于不耐寒品系;低溫脅迫5 d時(shí)，品系231和235的GSH/GSSG明顯高于品系161和163，說(shuō)明GSH/GSSG也是衡量甘藍(lán)植株氧化還原水平的一個(gè)指標(biāo)。

2. 3 低溫脅迫對(duì)AsA-GSH循環(huán)中主要酶活性的影響

從圖4-A可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系的APX活性均呈升高趨勢(shì)，且品系231和235的APX活性明顯高于品系161和163。其中，低溫脅迫3 d時(shí)，品系231、235和161的APX活性明顯升高，而品系163的APX活性顯著升高;低溫脅迫5 d時(shí)，4個(gè)甘藍(lán)品系的APX活性均維持在較高水平，且顯著高于低溫脅迫1 d時(shí)的APX活性，但與脅迫3 d時(shí)差異不顯著。說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系的AsA-GSH循環(huán)對(duì)H2O2的清除效果優(yōu)于對(duì)不耐寒品系。4個(gè)甘藍(lán)品系的GR活性則隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升（圖4-B），其中耐寒品系的升幅明顯高于不耐寒品系，說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系在低溫脅迫期間清除H2O2的能力明顯強(qiáng)于不耐寒品系。

從圖4-C可看出，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系的MDAR活性均顯著升高，且品系231和235的MDAR活性明顯高于品系161和163，說(shuō)明低溫脅迫均能迅速激活4個(gè)甘藍(lán)品系植株體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，及時(shí)清除ROS，尤其以耐寒品系對(duì)ROS的清除效果更佳。4個(gè)甘藍(lán)品系的DHAR活性均隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先顯著升高后顯著降低的變化趨勢(shì)（圖4-D），但品系231和235的DHAR活性明顯高于品系161和163，說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系在低溫脅迫時(shí)迅速激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)以減輕氧化傷害的效果優(yōu)于不耐寒品系。

2. 4 甘藍(lán)AsA-GSH循環(huán)中主要代謝物質(zhì)的綜合性分析

從圖5可看出，4個(gè)品系甘藍(lán)幼苗的H2O2和MDA含量變化趨勢(shì)一致，但耐寒品系的變化量明顯低于不耐寒品系;在低溫脅迫5 d時(shí)，耐寒品系的AsA和GSH含量變化趨勢(shì)與不耐寒品系相反，品系231和235在低溫脅迫5 d時(shí)AsA和GSH含量達(dá)峰值。說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系能在低溫脅迫期間維持較高水平的AsA-GSH循環(huán)來(lái)抵御氧化傷害。

3 討論

本研究中，隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)甘藍(lán)品系的MDA含量均呈增加趨勢(shì)，與劉艷菊等（2016）對(duì)油棕、周麗霞等（2017）對(duì)椰子幼苗的研究結(jié)果一致。劉艷菊等（2016）研究認(rèn)為，低溫脅迫下油棕幼葉中H2O2含量顯著增加，過(guò)量H2O2會(huì)造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和膜脂過(guò)氧化損傷，本研究結(jié)果與其一致，低溫脅迫下4個(gè)甘藍(lán)品系幼葉的H2O2均顯著增加，但耐寒品系的H2O2含量明顯低于不耐寒品系，說(shuō)明耐寒品系能迅速響應(yīng)低溫脅迫引起的氧化損傷。

本研究結(jié)果表明，低溫脅迫耐寒甘藍(lán)品系的AsA和GSH含量顯著增加，且增幅明顯高于不耐寒品系，說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系所受氧化損傷較輕，對(duì)低溫脅迫的耐受性較強(qiáng)，與Liu等（2009）的研究結(jié)果一致;在低溫脅迫期間，耐寒品系231和235的AsA/DHA和GSH/GSSG均高于不耐寒品系161和163，說(shuō)明耐寒甘藍(lán)品系可通過(guò)調(diào)節(jié)非酶抗氧化系統(tǒng)維持氧化還原平衡，從而增強(qiáng)植株的抗氧化能力，與Kamrun等（2015）、魏國(guó)芹等（2017）研究認(rèn)為較高的AsA/DHA和GSH/GSSG能保證AsA-GSH循環(huán)代謝正常運(yùn)轉(zhuǎn)，提高植株清除ROS能力，緩解低溫脅迫造成的氧化傷害的觀點(diǎn)一致。

Li等（2010）研究認(rèn)為，APX、MDAR、DHAR和GR是參與AsA-GSH循環(huán)的重要酶，能有效清除ROS。劉晶等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，APX可通過(guò)AsA將H2O2還原為H2O。本研究中，耐寒甘藍(lán)品系的APX活性在低溫脅迫期間呈上升趨勢(shì)，較高活性的APX可能提高了對(duì)ROS的清除能力;隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同甘藍(lán)品系幼葉的MDAR活性均呈下降趨勢(shì)，但不耐寒品系明顯低于耐寒品系。

4 結(jié)論

4 ℃低溫脅迫的甘藍(lán)耐寒品系231和235及不耐寒品系161和163均表現(xiàn)出氧化應(yīng)激響應(yīng)，但品系231和235較品系161和163更能迅速響應(yīng)脅迫，激活抗氧化系統(tǒng)，體內(nèi)的抗氧化酶活性明顯升高，非酶抗氧化劑含量明顯增加，能有效清除過(guò)量的ROS，維持植株體內(nèi)的氧化還原平衡，對(duì)低溫的耐受性更強(qiáng)。

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