尹馨，馬樹杰，李梅，鄧國華，侯玉杰，崔鵬飛，施建忠，陳化蘭

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150001）

0 引言

【研究意義】禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種嚴重危害家禽和人類健康的人畜共患病，其基因組是由 8個單股負鏈RNA組成，病毒在其復制過程中突變、重組頻繁，容易產生威脅動物和人類健康的新型流感病毒。低致病性H7N9亞型禽流禽感病毒（注：本文中若不特殊說明，低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均指的是對雞的致病性）自2013年在我國首次出現以來，不僅造成我國養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失，而且已經導致大量的人類感染及死亡[1]。2017年初，對家禽呈現低致病力的H7N9病毒進一步發(fā)生變異，在其病毒HA基因裂解位點區(qū)域增加了4個氨基酸，致使該類型病毒由對雞只的低致病性突變?yōu)楦咧虏⌒訹2]。流行病學研究發(fā)現，人類的感染源自接觸了H7N9病毒感染的家禽以及被污染的環(huán)境[3-8]。生物學特性研究發(fā)現，H7N9病毒之所以能夠感染并導致人死亡，與其病毒基因位點的突變以及獲得了一些致病力相關基因位點有關[8-12]。因此，開展H7N9病毒對哺乳動物的致病力研究及其致病機制研究，將起到預警和評估跨物種感染和對哺乳動物的致病能力變化，充實科學防控流感的重要科學依據，具有重要的現實意義和公共衛(wèi)生學意義?！厩叭搜芯窟M展】對2013年的H7N9病毒的研究表明，人源H7N9病毒與禽源H7N9病毒高度同源，從家禽中分離的H7N9病毒對家禽和哺乳動物并無致病力。但H7N9病毒在感染人后，很容易獲得PB2蛋白E627K，D701N的突變，進而能夠增強流感病毒在哺乳動物上的致病力和傳播能力，導致哺乳動物的感染和死亡[10,13-19]。2017年新發(fā)高致病性H7N9病毒在其堿性裂解位點區(qū)域獲得了4個氨基酸的插入，表現為對雞的高致病性，但裂解位點區(qū)域氨基酸的增加并不一定影響病毒對哺乳動物的致病性，試驗證明，早期的高致病性H7N9病毒對哺乳動物并無致病力，但高致病性病毒在獲得PB2蛋白 627K或者701N的突變后，可以獲得比2013年人源病毒更強的致病力，并可在雪貂之間經呼吸道飛沫傳播[2,20]。另外，在H5亞型流感病毒的致病力、傳播能力研究中，受體結合位點以及PB2蛋白627位點的改變或者是與人源流感病毒發(fā)生重組也不同程度的影響流感病毒對哺乳動物的致病力和傳播能力[21-30]?！颈狙芯壳腥朦c】在之前的研究中發(fā)現，對家禽呈現低致病力的H7N9病毒同樣對哺乳動物模型小鼠不表現任何的致病力[19]。但是，2015年，我們在湖南省的雞樣品中分離到一株低致病性H7N9病毒，A/chicken/Hunan/S40726/2015(H7N9) (簡稱HuN/S40726)，卻對哺乳動物小鼠表現為高致病力，其小鼠半數致死量（MLD50）為3.38 log10EID50/0.1mL。對比分析其影響病毒致病力的關鍵分子特征，發(fā)現其PB2蛋白627位點為V，有別于大多數禽源H7N9病毒627E和人源H7N9病毒627E/K。為了了解該病毒致病力的變化及其分子機制，我們開展了本研究?！緮M解決的關鍵問題】利用反向遺傳學技術，救獲HuN/S40726重組病毒驗證其致病力差異，通過定點突變技術，突變病毒PB2 蛋白的627位氨基酸，從而通過動物實驗驗證 PB2蛋白的 627V是否影響HuN/S40726毒株的致病力，并研究其致病力差異的分子機制。

1 材料與方法

試驗于 2016年在中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.1 病毒株與質粒

低致病性H7N9病毒（注：本文中若不特殊說明，低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均指的是對雞的致病性）A/Chicken/Hunan/S40726/2015（H7N9）（簡稱HuN/S40726），A/chicken/Shanghai/S1053/2013（H7N9）（簡稱 SH/S1053）由獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室分離鑒定并保存。其他用于PB2蛋白627位氨基酸分析比較的H5、H7亞型流感病毒序列均來自GISAID數據庫。雙向表達載體pBD以及真核表達載體pCAGGS由獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室保存。

1.2 主要試劑與材料

RNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司；RNA反轉錄酶購自日本TOYOBO公司；EasyTaqDNA聚合酶購自北京全式金生物公司；PCR產物純化試劑盒，膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；測序反應試劑盒BigDye Terminator 3.1購自美國ABI公司；同源重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質粒小提試劑盒購自康寧生命科學有限公司；質粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；轉染試劑（LipofectamineTM3000）購自 Invitrogen 公司；Primer STAR 購自TaKaRa公司；雙熒光素酶試劑盒購自Promega；6周齡BALB/c雌性小鼠（14—16 g）購自北京維通立華實驗動物有限公司；所用9—10日齡SPF雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.3 引物設計

依據HuN/S40726和SH/S1053病毒的基因全長序列分別設計 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和NS的8個基因克隆擴增引物和定點突變引物, 以及用于構建HuN/S40726和SH/S1053聚合酶復合表達質粒的克隆引物（表1）。

1.4 重組質粒的構建

提取 HuN/S40726毒株的病毒 RNA，按照TOYOBO反轉錄試劑盒說明書將病毒RNA反轉錄成cDNA，然后利用高保真酶Primer STAR和克隆引物擴增8個基因片段。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Omega膠回收試劑盒純化回收。同樣使用pBD克隆引物擴增pBD載體使之線性化，并用DpnI酶處理。利用Vazyme CloneExpress II 重組克隆試劑盒進行同源重組反應，將病毒的各片段克隆于pBD載體中。以病毒的PB2-pBD質粒為模版，按照點突變試劑盒的說明書進行突變反應，實現定點突變。陽性重組質粒經中提后用于轉染。

1.5 病毒的救獲以及序列鑒定

按照 LipofectamineTM3000脂質體轉染試劑盒方法，將病毒的8個片段的陽性重組質粒混合，每個陽性質粒500 ng，共轉染293T細胞，48 h后將細胞液接種9—10日齡雞胚，0.4 mL/枚，37℃培養(yǎng)，48 h后收取尿囊液進行血凝（HA）試驗，HA試驗陽性的尿囊液分裝凍存于-80℃。對救獲的病毒提取RNA，擴增全基因組進行測序，利用 DNAstar軟件比較救獲病毒與原病毒是否相同，以及突變毒株是否實現定點突變。

1.6 小鼠感染性試驗

救獲的病毒稀釋至 106EID50/50 μL，采用干冰麻醉小鼠，8只小鼠依次鼻腔接種50 μL。感染3d后，隨機剖殺3只小鼠，取腦、脾、肺、腎、鼻甲通過雞胚滴定，檢測病毒在小鼠各臟器內的復制情況。其余5只小鼠，每天觀察其臨床表現，記錄小鼠14 d內的體重變化。攻毒后小鼠飼養(yǎng)于IVC鼠籠中，提供優(yōu)質充足的飼料和飲水。環(huán)境溫度為21℃左右。

1.7 小鼠半數致死量（MLD50）的測定

將病毒稀釋至101—106EID50/50 μL，每個劑量鼻腔感染5只小鼠。每天觀察小鼠的臨床表現，記錄14 d內小鼠的體重變化以及死亡情況。根據Reed-Muench方法計算病毒的小鼠半數致死量（MLD50）。

1.8 聚合酶活性試驗

使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)來比較聚合酶的活性。構建HuN/S40726病毒及其突變病毒的聚合酶復合表達質粒系統(tǒng)，以 SH/S1053病毒為背景毒株構建聚合酶復合表達質粒系統(tǒng)作為對照，所用載體為pcDNA3.1載體。按照LipofectamineTM3000脂質體轉染試劑盒方法，將構建好的病毒的PB2，PB1，PA，NP表達質粒與螢火蟲熒光素酶報告質粒p-Luci以及內參TK質粒共轉染293T細胞，33℃和37℃下培養(yǎng)24 h后，裂解細胞，離心收取上清液，熒光素酶的測定按照熒光素酶試劑盒的推薦步驟進行。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結果

2.1 HuN/S40726毒株對BALB/c小鼠的致病性分析

本研究中，筆者通過對比研究低致病性H7N9代表毒株，HuN/S40726和SH/S1053病毒對哺乳動物模型小鼠的致病性，發(fā)現低致病性 H7N9代表株SH/S1053病毒僅能在小鼠的鼻甲和肺臟中低拷貝復制，且并不致死小鼠，其MLD50為≥6.5 log10EID50/ 0.1 mL（圖1-B）；然而，2015年在湖南分離的HuN/S40726病毒卻可以在小鼠的鼻甲和肺臟高效復制，并可以跨越血腦屏障，在小鼠的腦中復制，其 MLD50為 3.38 log10EID50/0.1 mL（圖1-A），呈現與SH/S1053病毒臟器復制能力的極顯著差異。

2.2 可能導致HuN/S40726病毒發(fā)生致病力變化的相關基因位點對比分析

在之前的研究中我們發(fā)現，對家禽呈現低致病力的H7N9病毒同樣對哺乳動物模型小鼠不表現任何的致病力[19]。通過分析上述兩個代表株致病能力差異的結果，我們認為HuN/S40726毒株呈現對小鼠的高致病力，有可能與其病毒基因發(fā)生了突變或者獲得了一些致病力相關基因位點有關。因此，我們對兩株代表毒株進行了可能導致毒株發(fā)生致病力變化的相關基因位點對比分析，結果發(fā)現兩株病毒僅在PB2蛋白627位氨基酸存在差異，HuN/S40726毒株為PB2/627V、SH/S1053毒株為PB2/627E（表2）

圖1 HuN/S40726毒株對BALB/c小鼠的致病力Fig. 1 Virulence of HuN/S40726 in BALB/c mice

2.3 PB2蛋白627位氨基酸分析

為確認PB2蛋白627V是否在自然界其他病毒中存在并是否大量存在，下載 GISAID數據庫中2013—2018年的H5、H7N9病毒的PB2基因序列，通過分析PB2蛋白627位氨基酸發(fā)現，PB2蛋白的627位氨基酸相對保守，幾乎所有禽源H5、H7N9病毒此位點為E；在1 148株人源H7N9病毒中，826株病毒為627K，288株病毒為627E，另外34株病毒存在627V（表 3）。上述結果顯示，自然界一直以來同時存在著627E/K/V 3種變體，更有可能代表著不同的致病力特征。

2.4 救獲病毒以及定點突變病毒對BALB/c小鼠的致病性

為了了解是否 PB2蛋白 E627V的改變導致HuN/S40726病毒的致病力變化，我們通過反向遺傳學技術、點突變技術，分別救獲 rHuN/S40726重組毒以及兩株單點氨基酸突變病毒，rHuN/S40726-PB2/627E、rHuN/S40726-PB2/627K。以106EID50/ 0.05ML感染小鼠，結果顯示，rHuN/S40726-PB2/627K點突變病毒能在小鼠的鼻甲和肺臟中高效復制，在腦中低拷貝復制，MLD50為4.5 log10EID50，與以往的研究報道中PB2/627K能夠增強病毒對哺乳動物的致病力結果相一致[13-19]；rHuN/S40726重組病毒與HuN/S40726野生毒株對小鼠的致病力一致，均能致死小鼠，MLD50分別為 3.5 log10EID50和3.38 log10EID50，說明rHuN/S40726重組病毒對小鼠一樣呈現對小鼠的高致病性特征；rHuN/S40726重組病毒點突變株rHuN/S40726-PB2/627E僅在小鼠的鼻甲和肺臟中復制，不能在小鼠的腦內復制，也不能造成小鼠的死亡，其 MLD50大于 6.5 log10EID50，相比rHuN/S40726重組毒致病力降低了至少1 000倍（詳見圖2）。以上結果說明，PB2蛋白V627E的突變可以明顯降低HuN/S40726病毒對小鼠的致病力。

表2 代表毒株致病力相關基因位點對比分析Table 2 Comparative analysis of the genetic site in the pathogenic factors of the H7N9 strain

表3 自然界中H5、H7N9病毒PB2蛋白627位點氨基酸分析Table 3 Analysis of PB2 protein 627 Aa site in H5 and H7N9 viruses in nature

2.5 聚合酶活性檢測

PB2蛋白627位氨基酸的改變，一般會影響病毒聚合酶活性，本研究中筆者推測HuN/S40726病毒PB2蛋白E627V改變影響了病毒聚合酶活性，進而改變了病毒對哺乳動物的致病性。為進一步揭示HuN/S40726病毒PB2蛋白627V影響病毒對小鼠致病力的內在機制，構建了HuN/S40726病毒PB1、PA、NP基因以及PB2的3種突變基因表達質粒，通過在細胞上表達聚合酶來分析PB2蛋白627位氨基酸的突變對聚合酶活性的影響。結果顯示，不論是在33℃還是37℃下，與 PB2/627E共表達質粒組合相比，PB2/627V，PB2/627K組合均能提高病毒在哺乳動物細胞中的聚合酶活性，與病毒的致病性呈正相關（圖 3-A）。同樣的，以SH/S1053病毒為背景，PB2/627V、PB2/627K組合也均能提高H7N9病毒的聚合酶活性（圖3-B），遠高于PB2/627E共表達質粒組合的聚合酶表達活性。

3 討論

自2013年中國上海市出現全球首例人感染H7N9病毒并死亡病例以來，H7N9病毒一直在威脅著人類的健康。截止2018年3月2日，H7N9病毒已有全球范圍內實驗室確診病例1 567例，包括死亡病例615例（http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/HAI_Risk_Assessment/en/）。而經過4年來病毒在家禽中的不斷傳播、遺傳進化，2017年初，低致病性的H7N9病毒在其裂解位點區(qū)域增加了4個氨基酸的插入（-KRTA-），使得該類型病毒突變成了高致病性H7N9病毒，給我國的養(yǎng)禽業(yè)以巨大的打擊。

流感病毒是一種單股負鏈 RNA病毒，頻繁的變異是它的天性。將低致病性流感病毒突變?yōu)楦咧虏⌒粤鞲胁《臼亲畈幌ＭO(jiān)測到的突變，使得一種新型流感病毒可以在人類中飛沫傳播。在本研究中，筆者通過常規(guī)監(jiān)測在1株低致病性H7N9病毒中發(fā)現了這個令人擔憂的PB2 E627V突變，這種突變使得對哺乳動物小鼠的致病力增加1 000倍以上，彰顯了單個基因位點改變病毒致病力特性的巨大作用。而一旦該類病毒在家禽中得以傳播開來，對人的致病性風險將增加很大。該發(fā)現為防控H7N9提供了科學依據。

以往研究數據顯示，病毒的單個基因/關鍵性位點或多個基因/關鍵性位點往往決定著流感病毒致病力和傳播能力的變化[11]。在H5、H7N9流感病毒研究中，有關PB2蛋白627位氨基酸的改變，均顯示影響著病毒對宿主的致病力變化和是否能夠在宿主間具有傳播能力[13-20]。PB2蛋白627K（絕大多數人源流感病毒存在此氨基酸）是禽流感病毒能在哺乳動物細胞中有效復制的關鍵影響位點。相反的，基本上全部的禽源病毒具有PB2 627 E（絕大多數禽源流感病毒存在此氨基酸）也因為該位點限制了禽源病毒在哺乳動物體內的復制能力[16,19]。最近的一項研究表明，流感病毒PB2蛋白 627位點的突變與宿主體內的 ANP32A蛋白有關，ANP32A充當“內鬼”，輔助病毒進入細胞后復制活動，而禽流感無法利用哺乳動物的ANP32A蛋白，除非病毒發(fā)生 PB2蛋白 E627K的突變[31]。我們之前報道過低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均對小鼠無致病力，而當病毒在哺乳動物體內獲得PB2蛋白E627K，D701N等突變后，H7N9病毒對小鼠、雪貂的致病力可以顯著的提高甚至致死小鼠和雪貂，并可在雪貂之間經呼吸道飛沫傳播[2,19]。本研究中，筆者在2015年對湖南省開展動物流感病毒監(jiān)測中，分離到 1株對小鼠表現為高致病力的 H7N9病毒（HuN/S40726），對其致病力、傳播能力等關鍵性的分子特征進行分析后，發(fā)現其PB2蛋白627位氨基酸為V，其有別于禽源H7N9病毒特征的PB2蛋白627E和人源H7N9病毒特征的PB2蛋白627K。是否該病毒PB2蛋白627V使得HuN/S40726病毒對小鼠呈高致病性。通過反向遺傳學技術，救獲了 HuN/S40726重組毒以及對其 PB2 627位氨基酸突變的重組毒株rHuN/S40726-PB2/627E、rHuN/S40726-PB2/627K。通過小鼠致病性評估試驗，PB2蛋白E627V的改變顯著的增強了HuN/S40726病毒對小鼠的致病力，使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50變化為3.5 log10EID50，病毒毒力增強了1 000倍以上。進一步的分子機制研究發(fā)現，HuN/S40726病毒通過顯著提高HuN/S40726病毒在哺乳動物細胞中的聚合酶活性，改變了該病毒對小鼠的致病性。綜上所述，PB2蛋白的 627V是HuN/S40726病毒對哺乳動物小鼠表現高致病力的重要分子基礎。

圖2 救獲病毒對BALB/c小鼠的致病力Fig. 2 Virulence of rescued viruses in BALB/c mice

圖3 H7N9禽流感病毒的聚合酶活性Fig. 3 Polymerase activity of H7N9 avian influenza virus

分析GISAID數據系統(tǒng)下載的2013-2018年的人源H7N9病毒序列，我們發(fā)現人源H7N9病毒中已經存在部分的病毒具有 PB2蛋白 627V，而禽源 H7N9病毒中并未發(fā)現具有PB2蛋白627V的毒株，顯示該類型對人的感染同樣存在大的風險性。因此，對于H7N9病毒還應采取不間斷的流行病學調查工作，密切關注其遺傳進化以及生物學特性的變化。

4 結論

PB2蛋白627位氨基酸（V）決定了HuN/S40726病毒對小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改變能夠顯著增強HuN/S40726病毒在哺乳動物細胞中的聚合酶活性，是引起HuN/S40726病毒對哺乳動物致病力的重要因素。