曹雄軍，盧曉鵬，熊江，李靜，謝深喜

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/國(guó)家柑橘改良中心長(zhǎng)沙分中心，長(zhǎng)沙 410128；2廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，南寧 530007）

0 引言

【研究意義】我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)主要分布在南方丘陵山地，容易受到土壤干旱脅迫的影響。即使我國(guó)南方濕潤(rùn)地區(qū)也經(jīng)常會(huì)在 7—9月份發(fā)生區(qū)域性和季節(jié)性的干旱[1]，此時(shí)正值柑橘果實(shí)膨大及品質(zhì)產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期，如橘園不能有效地通過(guò)灌溉來(lái)解決干旱問(wèn)題，則會(huì)給柑橘的安全生產(chǎn)帶來(lái)較大壓力。干旱脅迫影響氮素營(yíng)養(yǎng)的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝[2]。氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組分，參與和調(diào)節(jié)植物在干旱逆境下的適應(yīng)、傷害、修復(fù)和補(bǔ)償?shù)壬砩^(guò)程[3-4]。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期研究表明，隨著干旱脅迫的加劇，柑橘葉片葉綠素含量下降，柑橘體內(nèi)吸收的氮素含量減少[5]。目前，隨著全球氣候變暖和生態(tài)環(huán)境的惡化，干旱發(fā)生的頻率和強(qiáng)度均有所加劇[6-7]，干旱脅迫給柑橘安全生產(chǎn)帶來(lái)的壓力越來(lái)越突出。柑橘的水分生理和營(yíng)養(yǎng)吸收研究密不可分，在干旱條件下，研究柑橘對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，以及氮素代謝機(jī)制等，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中調(diào)控柑橘生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)與產(chǎn)量具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】柑橘屬于典型的亞熱帶樹(shù)種，喜溫暖、濕潤(rùn)的生態(tài)環(huán)境，對(duì)水分有較高的需求[8]。水分的缺失會(huì)使柑橘的形態(tài)發(fā)生變化，如植株生長(zhǎng)緩慢或停止、葉片和嫩莖萎蔫、葉片枯死和脫落；使葉片氣孔開(kāi)度減小甚至關(guān)閉[9-11]，與光合作用有關(guān)的細(xì)胞器受損，導(dǎo)致葉片光合速率下降[12-15]；也影響根系對(duì)礦質(zhì)元素（N、P、K 等）吸收[5,16-17]。因此，干旱脅迫對(duì)柑橘的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)與產(chǎn)量具有極為不利的影響[18]。研究發(fā)現(xiàn)，豆科植物根瘤形成依賴(lài)于起始結(jié)瘤基因（nodule inception，NIN）的存在，而在非豆科植物中，也有類(lèi)似基因存在，參與硝酸鹽的同化，命名為NLP（NIN-like protein）基因[19]。研究表明，擬南芥（Arabidopsis thaliana）NLP轉(zhuǎn)錄因子不僅在調(diào)控氮素吸收與同化中扮演著非常重要的角色[20-23]，而且與擬南芥的抗旱性有關(guān)[24]。NIN-like家族蛋白具有感知硝酸鹽信號(hào)的能力，能與硝酸鹽響應(yīng)順式作用元件（nitrate-responsive cis-element，NRE）綁定，激活依賴(lài)NRE啟動(dòng)的基因表達(dá)[20-21]。另外研究人員發(fā)現(xiàn)，敲除了AtNLP7的擬南芥相比正常野生型表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗旱能力[24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】到目前為止，關(guān)于柑橘 NLP轉(zhuǎn)錄因子參與氮素吸收與同化還未有深入研究，因此，本文針對(duì)枳（Poncirus trifoliata(L.)Raf.）氮素含量受干旱的影響，探討枳NLP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，以及其與NRE的互作關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析干旱條件下枳葉片和側(cè)根中氮素含量的變化以及枳亞硝酸還原酶基因（PtNiR）和NLP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，克隆PtNiR啟動(dòng)子序列并進(jìn)行順式作用元件分析，運(yùn)用酵母單雜交技術(shù)分析驗(yàn)證枳NLP轉(zhuǎn)錄因子與NiR啟動(dòng)子上硝酸鹽響應(yīng)順式作用元件的互作關(guān)系。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015—2017 年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家柑橘改良中心長(zhǎng)沙分中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為枳播種實(shí)生苗，種子來(lái)源于湖南省洞口縣洞口鎮(zhèn)大田村同一棵母本株‘大田1號(hào)’，遺傳基礎(chǔ)一致。枳實(shí)生苗栽培于溫室大棚中的塑料盆中（直徑25 cm，高度23 cm），其中試驗(yàn)植株108株，樹(shù)齡為1年生并生長(zhǎng)一致，栽培基質(zhì)由草炭、鋸木屑及細(xì)河沙按照1∶2∶1的比例混勻而成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枳干旱處理及采樣 以植株統(tǒng)一澆透水為處理第1天，此后每天在上午9：00—10：00用土壤水分測(cè)量?jī)x（TDR300，USA）監(jiān)測(cè)栽培基質(zhì)的持水量。干旱組的基質(zhì)不再補(bǔ)充水分直到觀察到植株葉片萎蔫，而對(duì)照組的基質(zhì)相對(duì)持水量下降至55%—65%時(shí)，每2 d補(bǔ)充適量水分使對(duì)照基質(zhì)保持在該范圍。處理期間采集干旱組和對(duì)照組試驗(yàn)分析樣本3次，即統(tǒng)一澆水后第7天基質(zhì)相對(duì)持水量在55%—65%范圍時(shí)采樣一次；第27天干旱組基質(zhì)相對(duì)持水量在18%—22%時(shí)采樣一次；第37天干旱組觀察到植株葉片萎蔫、基質(zhì)相對(duì)持水量在12%—16%時(shí)采樣一次，每次采樣干旱組和對(duì)照組分別采集3組重復(fù)，每組6株，其中3株采集新梢頂部3—5片葉，以及根部幼嫩側(cè)根，用于RNA提取和熒光定量PCR分析；另外3株采集全部葉片和側(cè)根用于氮素含量的測(cè)定。

1.2.2 氮素含量的測(cè)定 將待測(cè)枳葉片、側(cè)根樣品取好后，立即用水洗凈，在烘箱中設(shè)置15 min 120℃，然后于65℃條件下烘干至恒重，研磨成粉后采用凱氏定氮儀測(cè)定全氮含量。

1.2.3 枳DNA提取 用液氮研磨葉片，參照CTAB法提取枳 DNA。使用超微量分光光度計(jì)（Implen P330，德國(guó)）檢測(cè) DNA濃度與純度，同時(shí)用 1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性，檢測(cè)合格后，貯于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RNA提取及 cDNA制備 使用 Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）參照說(shuō)明書(shū)的步驟提取枳葉片和側(cè)根的總RNA，之后在超微量分光光度計(jì)（Implen P330，德國(guó)）上檢測(cè)RNA濃度與純度，同時(shí)用1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的完整性，檢測(cè)合格后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），TaKaRa）制備實(shí)時(shí)熒光定量分析cDNA模板，完成后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物設(shè)計(jì) 參照甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列，使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)枳NLP基因全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增引物[23]，設(shè)計(jì)PtNiR的啟動(dòng)子擴(kuò)增引物；使用Beacon Designer 8設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表1）。

1.2.6 熒光定量PCR分析 儀器采用BIO-RAD公司的CFX96 real-time PCR儀。擴(kuò)增條件設(shè)置為兩步法：95℃預(yù)變性30 s后，95℃變性5 s，58℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品 3次重復(fù)。選擇 YAN等[25]報(bào)道的ActinB作為內(nèi)參基因，分別以對(duì)照樣品為參照分析基因的差異表達(dá)。根據(jù)LIVAK等[26]報(bào)道的2-ΔΔCT法分析枳葉與側(cè)根的qPCR數(shù)據(jù)，并使用SPSS軟件對(duì)基因相對(duì)樣品的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.7 基因克隆與酵母單雜交互作載體構(gòu)建 使用高保真 DNA聚合酶（PrimerSTAR Max DNA Polymerase，TaKaRa）PCR擴(kuò)增枳 NLP轉(zhuǎn)錄因子及PtNiR啟動(dòng)子，擴(kuò)增的目的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，把預(yù)期片段大小的目的條帶切膠、回收純化后，使用必克隆試劑盒（Ligation-Free Cloning Kit，abm），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選培養(yǎng)，然后提取載體質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。枳4×NRE序列由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成并連接至pHIS2載體。

1.2.8 酵母單雜交分析 按照酵母單雜交步驟將構(gòu)建的pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec-NLP載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到酵母菌株 Y187中，在氨基酸缺失培養(yǎng)基 SD/-Trp/-Leu（對(duì)照）以及 SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L-13-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）上30℃恒溫培養(yǎng)3—5 d，觀察酵母的生長(zhǎng)情況，以共轉(zhuǎn)化pHIS2-4×NRE和pGADT7-Rec空載體的Y187酵母為陰性對(duì)照。

表1 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物Table 1 Primers designed in this study

2 結(jié)果

2.1 干旱條件下枳氮素含量的變化

在干旱組中，葉片全氮含量表現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì)，而側(cè)根中全氮含量顯著下降；在對(duì)照組中，枳葉片和側(cè)根全氮含量均顯著上升（圖 1）。以對(duì)照為參比，全氮含量在枳葉片和側(cè)根中均隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)而相對(duì)減少。

圖1 干旱處理后枳葉和側(cè)根中的全氮含量Fig. 1 The total nitrogen content in leaves and lateral roots of P. trifoliata after drought treatment

2.2 干旱條件下PtNiR的表達(dá)

分析了干旱條件下亞硝酸還原酶PtNiR（NCBI登錄號(hào) KX792147）在葉片和側(cè)根的表達(dá)情況，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)?7天基質(zhì)相對(duì)持水量在18%—22%時(shí)，葉PtNiR的表達(dá)水平上調(diào)超過(guò)處理第7天，但不顯著，而側(cè)根PtNiR的表達(dá)水平有所下調(diào)且顯著低于處理第7天；當(dāng)?shù)?7天觀察到植株葉片萎蔫，基質(zhì)相對(duì)持水量在12%—16%范圍時(shí)，葉和側(cè)根PtNiR的表達(dá)水平均顯著下調(diào)至更低的水平（圖2）。

圖2 枳葉和側(cè)根中PtNiR的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 The relative expression of PtNiR in leaves and lateral roots of P. trifoliata

2.3 干旱脅迫下枳NLP基因的表達(dá)

分析了本試驗(yàn)條件下PtNLP2（NCBI登錄號(hào)：KX056268）、PtNLP4（NCBI登錄號(hào)：KX056269）、PtNLP7（NCBI登錄號(hào)：KX056270）及PtNLP8（NCBI登錄號(hào)：KX056271）在葉片和側(cè)根的表達(dá)量（圖3、圖 4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葉片中，PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7的表達(dá)趨勢(shì)相似，干旱第27天（基質(zhì)相對(duì)持水量在18%—22%時(shí)）的表達(dá)量相對(duì)干旱第7天（基質(zhì)相對(duì)持水量在55%—65%時(shí)）顯著上調(diào)，到干旱第37天（植株葉片萎蔫，基質(zhì)相對(duì)持水量在12%—16%時(shí)），它們的表達(dá)量有所下調(diào)，其中，PtNLP4、PtNLP7下調(diào)至干旱第7天的表達(dá)量水平以下，但PtNLP2仍顯著高于干旱第7天。PtNLP8的表達(dá)量在干旱第27天有所下調(diào)，低于第7天的表達(dá)量但無(wú)顯著差異。

圖3 枳葉中NLP基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 The relative expression of NLP genes in leaves of P.trifoliata

而在枳側(cè)根中，同樣，PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在干旱第27天（基質(zhì)相對(duì)持水量在18%—22%時(shí)）的表達(dá)量相對(duì)干旱第 7天（基質(zhì)相對(duì)持水量在 55%—65%時(shí)）上調(diào)，其中PtNLP2、PtNLP7顯著上調(diào)；到干旱第37天（植株葉片萎蔫，基質(zhì)相對(duì)持水量在12%—16%時(shí)），它們的表達(dá)量有所變化，其中，PtNLP2表達(dá)下調(diào)但仍顯著高于干旱第7天，PtNLP4表達(dá)下調(diào)至干旱第7天的表達(dá)水平以下，PtNLP7表達(dá)與干旱第7天無(wú)顯著性差異。PtNLP8的表達(dá)量在干旱第27天、第37天相比第7天均有所下調(diào)但無(wú)顯著差異。

從基因表達(dá)模式的角度分析，PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7之間存在相似性，但與PtNLP8存在差異。NLP與PtNiR表達(dá)模式上具有一定的相關(guān)性，表明枳NLP轉(zhuǎn)錄因子與PtNiR表達(dá)可能存在關(guān)聯(lián)，因此，克隆分析了PtNiR的啟動(dòng)子序列，并發(fā)現(xiàn)一段疑似NRE序列。

圖4 枳側(cè)根中NLP基因的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of NLP genes in lateral roots of P. trifoliata

2.4 PtNiR啟動(dòng)子的克隆及序列分析

通過(guò)克隆測(cè)序獲得了包括 1 602 bp啟動(dòng)子的PtNiR序列（NCBI登錄號(hào)KX792147）。通過(guò)檢索比對(duì)分析，在PtNiR啟動(dòng)子區(qū)域-196至-154的位置發(fā)現(xiàn)了疑似 NRE，該 NRE由一個(gè)高保守 motif（TG(A/G)C(C/T)CTT）以及另一個(gè)低保守motif組成（圖 5-A、5-B），枳 NRE的第一個(gè) motif序列為“TGACCCTT”，第二個(gè) motif序列為“AAGAGTCC”，與菜豆（Phaseolus vulgaris）、菠菜（Spinacia oleracea）一致，與擬南芥、白樺（Betula pendula）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、水稻（Oryza sativa）類(lèi)似（圖5-A）。

2.5 枳NLP轉(zhuǎn)錄因子與NRE互作分析

圖5 硝酸鹽響應(yīng)順式作用元件（NRE）Fig. 5 Nitrate-responsive cis-element (NRE)

為分析和驗(yàn)證枳NLP轉(zhuǎn)錄因子與NRE的互作，構(gòu)建了含有4×NRE-HIS3報(bào)告基因的pHIS2載體，并分別構(gòu)建了融合PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的表達(dá)載體pGADT7-Rec。分別將pHIS2-4×NRE-HIS3和 pGADT7-Rec-NLP2、pHIS2-4×NREHIS3和pGADT7-Rec-NLP4、pHIS2-4×NRE-HIS3和pGADT7-Rec-NLP7、pHIS2-4×NRE-HIS3和pGADT7-Rec-NLP8、pHIS2-4×NRE-HIS3和 pGADT7-Rec共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187中，生長(zhǎng)在對(duì)照（/-Trp/-Leu）及篩選（/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L-13-AT）培養(yǎng)基上。結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)化pHIS2-4×NRE-HIS3載體和不含NLP的pGADT7-Rec空載體的Y187酵母在對(duì)照培養(yǎng)基（-Trp/-Leu）能正常生長(zhǎng)，而在含有120 mmol·L-13-AT的三缺培養(yǎng)基（-His/-Trp/-Leu）上不生長(zhǎng)，說(shuō)明酵母單雜交系統(tǒng)工作正常；轉(zhuǎn)化pHIS2-4×NRE-HIS3載體和pGADT7-Rec-NLP載體的Y187酵母在對(duì)照培養(yǎng)基（-Trp/-Leu）和含有120 mmol·L-13-AT的三缺培養(yǎng)基（-His/-Trp/-Leu）上均能正常生長(zhǎng)。該結(jié)果表明在Y187酵母中，PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8均能與NRE綁定互作，暗示枳NLP轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)綁定NRE結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控PtNiR表達(dá)。

圖6 酵母單雜交分析枳NLP轉(zhuǎn)錄因子與NRE的互作關(guān)系Fig. 6 Analysis of interaction between NLP transcription factor and NRE in P. trifoliata by Y1H assay

3 討論

研究表明，受干旱脅迫的影響，山下紅溫州蜜柑和紐荷爾臍橙的氮素吸收量顯著低于正常澆灌處理，且隨著土壤干旱程度的加深而減少[5]。本試驗(yàn)的全氮含量結(jié)果表明，從處理后第7天到葉片開(kāi)始萎蔫的第37天，無(wú)論是葉片，還是與氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)直接相關(guān)的側(cè)根，其本身的全氮含量均顯著減少，且相比對(duì)照，其相對(duì)含量也顯著減少。因此可見(jiàn)，干旱脅迫顯著影響柑橘的氮素營(yíng)養(yǎng)，這可能與干旱脅迫能誘導(dǎo)或抑制氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

硝酸鹽是高等植物中的主要氮源，也起到誘導(dǎo)生長(zhǎng)和基因表達(dá)變化的信號(hào)分子的作用。硝酸鹽的同化作用是一個(gè)受到高度調(diào)控的過(guò)程，其受到氮素代謝如亞硝酸還原酶（NiR）等相關(guān)基因表達(dá)的影響[19,27-28]。本研究分析結(jié)果表明，枳側(cè)根中的亞硝酸還原酶PtNiR表達(dá)受到干旱脅迫的抑制，且隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量顯著下調(diào)。然而，PtNiR表達(dá)變化可能是受到干旱脅迫的直接影響，也可能是受到其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。氮素代謝途徑中存在一些在硝酸鹽吸收以及同化的過(guò)程中起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子[20-22,29-31]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中 NLP轉(zhuǎn)錄因子的活性可以受硝酸鹽信號(hào)的調(diào)節(jié)，其蛋白能與硝酸鹽響應(yīng)順式作用元件（NRE）綁定結(jié)合，從而激活相關(guān)基因的表達(dá)[20-21]。另外，敲除AtNLP7后，擬南芥表現(xiàn)出明顯的缺氮狀態(tài)，也表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱性[24]。原生質(zhì)免疫共沉淀雜交技術(shù)分析也表明擬南芥AtNLP7參與到氮代謝及相關(guān)的途徑中[23,32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮素代謝中發(fā)揮著重要功能的NLP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)響應(yīng)干旱脅迫，這對(duì)于解析柑橘在干旱條件下氮素調(diào)控的分子機(jī)制非常重要。

KONISHI等分析了幾種高等植物的NiR啟動(dòng)子的序列，鑒定出一個(gè)保守序列（5′-tGACcCTTN10AAGagtcc-3′）作為 NRE，而且在擬南芥NiR啟動(dòng)子中的NRE可以直接受硝酸鹽應(yīng)答轉(zhuǎn)錄，但突變了該保守序列后，啟動(dòng)子的硝酸鹽響應(yīng)活性顯著降低，表明NRE是硝酸鹽應(yīng)答轉(zhuǎn)錄所必需的[33-34]。通過(guò)序列分析，在PtNiR啟動(dòng)子區(qū)域-196至-154的位置發(fā)現(xiàn)了疑似 NRE，并且應(yīng)用酵母單雜交分析確定了 PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8轉(zhuǎn)錄因子均能與4×NRE位點(diǎn)結(jié)合互作，激活下游基因的表達(dá)。這進(jìn)一步在理論上表明NLP可以通過(guò)綁定NRE位點(diǎn)激活PtNiR的表達(dá)。因此，枳NLP轉(zhuǎn)錄因子在柑橘的氮素代謝中可能也起著非常重要的作用，其表達(dá)水平不僅影響柑橘對(duì)氮素的吸收與同化，也與柑橘的抗旱性有著某種聯(lián)系。

4 結(jié)論

干旱脅迫影響枳的全氮含量以及PtNiR和NLP基因的表達(dá)，特別是側(cè)根中全氮含量顯著下降，其PtNiR表達(dá)受到干旱脅迫的抑制，且隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量顯著下調(diào)。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8的表達(dá)均響應(yīng)干旱脅迫但存在差異。在PtNiR啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了硝酸鹽響應(yīng)順式作用元件（NRE），PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8轉(zhuǎn)錄因子均能與NRE位點(diǎn)綁定互作，從而激活下游基因的表達(dá)。