郝俊杰，李磊，王波，秦玉紅，崔健，王瑛，王佩圣，江志訓，孫吉祿，王珍青，岳歡，張守才

（青島市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東青島 266100）

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativusL.）是主要的蔬菜之一，在世界各地廣泛栽培。而白粉病是危害黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一，對白粉病抗性基因的精細定位是克隆抗性基因并建立白粉病分子標記輔助選擇育種體系的基礎?！厩叭搜芯窟M展】由于白粉病病原菌種類或生理小種不明確、實驗材料各異、鑒定方法和病情分級標準不同等因素，造成黃瓜白粉病抗性遺傳規(guī)律研究結論存在較大差異，主要有以下4種觀點。第一種觀點認為黃瓜白粉病抗性是由隱性多基因控制，且為數(shù)量性狀[1-2]。第二種觀點認為黃瓜白粉病抗性是由隱性單基因控制[3-4]。第三種觀點認為黃瓜白粉病抗性是由1對不完全隱性基因和2對上位修飾基因控制[5-8]。第四種觀點認為黃瓜白粉病抗性是由顯性基因控制[9]。目前，對于黃瓜白粉病基因的定位研究已有較多的報道[10-13]。例如，沈麗平[10]采用復合區(qū)間作圖法檢測到2個白粉病抗性QTL位點，位于第3連鎖群上，貢獻率分別為7.6%和13.5%。劉龍洲等[12]在兩種環(huán)境里共檢測到4個分布于連鎖群1、2、4和6上的黃瓜白粉病抗性QTL，單個QTL解釋貢獻率介于5.2%—21.0%。張圣平等[13]檢測到一個位于 5號染色體上的QTL（Pm5.2），并認為其為主效QTL位點，此位點與SSR00772緊密連鎖?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，新一代測序技術的發(fā)展，SNP標記的應用越來越廣泛，也隨之產(chǎn)生了基于全基因組測序的 BSA-seq技術。該技術極大程度的提高了基因定位的準確性和效率，并且已經(jīng)廣泛應運于藜麥、水稻、鷹嘴豆等作物中[14-16]，而在黃瓜中鮮有報道。2009年黃瓜基因組全測序的完成，為在黃瓜中利用BSA-seq技術定位基因提供了序列基礎[17]?！緮M解決的關鍵問題】以高抗白粉病自交系‘74’和高感白粉病自交系‘80’為親本配置組合，構建F2分離群體；并利用BSA分池法結合二代測技術進行白粉病基因的初步定位；在此基礎上在進一步在候選區(qū)段內(nèi)開發(fā)分子標記，對白粉病抗性基因進行精細定位。

1 材料與方法

試驗于2013年—2016年在青島市農(nóng)業(yè)科學研究院進行。

1.1 試驗材料

試驗材料由青島市農(nóng)業(yè)科學研究院蔬菜研究所黃瓜課題組提供。母本自交系‘74’（簡稱74）為2003年從青島國際種苗有限公司引進的華北型黃瓜種質(zhì)，為高抗白粉病的自交系；父本自交系‘80’（簡稱80）為2001年從日本引進的華南型黃瓜種質(zhì)，是高感白粉病的自交系。74×80雜交獲得 F1種子，F(xiàn)1自交獲得233個F2單株。用于接種鑒定的病菌是單囊殼白粉菌Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.exFr.）Poll.），由青島市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所黃瓜課題組提供，2015年3—5月在青島市農(nóng)科院李滄試驗基地進行接菌鑒定。

1.2 黃瓜白粉病成株抗性鑒定

將黃瓜自交系‘74’、自交系‘80’以及雜交F1和 F2代種子浸泡催芽后播種于經(jīng)高溫滅菌的營養(yǎng)土中。黃瓜幼苗植株長至5—6葉期，將其移栽至黃瓜塑料大棚內(nèi)。待黃瓜植株長至14—15葉期時，用小型手持噴霧器將接種液均勻地、充分地噴在黃瓜整個植株葉片的正、反兩面，直至葉片透濕。接種后，大棚內(nèi)濕度控制在70%—80%，溫度控制在25—28℃，持續(xù)黑暗12—16 h后恢復正常光照，15 d后進行病情調(diào)查。

植株病情鑒定方法和分級標準參考 2010年國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準-黃瓜抗白粉病鑒定技術規(guī)程（NY/T1857.2—2010）[18]。病情分級標準根據(jù)病斑面積和感病程度分為6個級別：0級：無任何病癥；1級：病斑面積占葉面積的 1/3以下，白粉狀病斑模糊不清；3級：病斑面積占葉面積的 1/3—2/3，白粉狀病斑較為明顯，但分散不連片；5級：病斑面積占葉面積的2/3以上，白粉狀病斑連片，葉片開始變黃；7級：白粉層濃厚，由葉緣向里變褐；9級：葉片變褐壞死斑面積占葉面積的2/3以上，葉緣上卷[18]。

1.3 黃瓜DNA的提取和PCR擴增

采用改良的CTAB法[19]提取親本、F2單株基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，用紫外分光光度計檢測其濃度，根據(jù)測定結果將樣品稀釋到50 ng·μL-1備用。PCR 反應體系 20 μL，含 100 ng基因組 DNA 2 μL、10×PCR 緩沖液 2 μL、25 mmol·L-1MgCl22 μL、20 mmol·L-1dNTPs 0.4 μL、2 μmol·L-1上下游引物各0.75 μL、1 U TaqDNA聚合酶0.05 μL，ddH2O補至20 μL。反應程序為94℃預變性4 min；94℃變性 30 s，51—54℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min，4℃冰箱保存。擴增產(chǎn)物用 5%的變性聚丙烯酰胺凝膠 50 W 恒功率電泳分離，銀染顯色后進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 抗感池的建立和及重測序

根據(jù)田間接種調(diào)查得到的黃瓜單株病情指數(shù)結果，從F2群體中選擇抗病性最好及感病最嚴重的極端材料構建抗感池?？垢谐匕?0個單株，單株取其幼嫩葉片并提取DNA后，單株取等量DNA混合構建抗感池。

將20 μg抗感池基因組DNA進行建庫測序，采用Illumina Hiseq 2000測序儀進行雙末端（pair-ended）測序，得到的讀長為2×100 bp，要求獲得5 GB數(shù)據(jù)量（深圳華大基因）。

對質(zhì)量控制后的序列數(shù)據(jù)比對黃瓜參考基因組，獲得抗感池的SNP位點信息，計算SNP-index值[20]。

1.5 定位所用的分子標記

本研究所用標記包括兩部分。290對SSR標記來源于高密度黃瓜SSR遺傳圖譜[21]。針對候選區(qū)段的序列在兩個親本間的差異，利用Primer Premier 5軟件設計38對In/Del標記[22]。

1.6 遺傳作圖

將候選染色體的分子標記對 F2群體進行多態(tài)性檢測，統(tǒng)計各單株帶型，與自交系‘74’帶型一致的記為“A”，與自交系‘80’帶型一致的記為“B”，雜合記為“H”，缺少或不正常條帶均記為“-”。最后利用QTL IciMaping軟件計算分子標記與目的基因之間的遺傳距離，并繪制連鎖圖譜[23]。

2 結果

2.1 表型鑒定與遺傳分析

本研究論文中選用的親本自交系‘74’對白粉病菌表現(xiàn)免疫（0級），而自交系‘80’對白粉病菌表現(xiàn)為感?。?級）（圖1）。為了分析自交系‘74’對白粉病成株抗性的遺傳，對F1植株接種白粉病菌，所有 F1植株均感白粉病，且具有與其感病親本自交系‘80’相似的侵染型（5級），介于雙親之間，說明自交系‘74’對白粉病的抗性是不完全隱性的。F2群體單株的發(fā)病級別為1—9，平均值為4.55；其中1級發(fā)病植株占32.4%，3級發(fā)病植株占13.2%，5級發(fā)病植株占20.5%，7級發(fā)病植株占11.9%，9級發(fā)病植株占21.9%，F(xiàn)2群體中發(fā)病級別呈現(xiàn)連續(xù)分布。表明抗病親本中含有的抗病性狀可能是由數(shù)量性狀控制。

圖1 供試黃瓜抗感親本體接菌后表型（A：74；B：80）Fig. 1 Parents phenotypes after inoculation (A:74; B: 80)

2.2 抗性基因的初步定位

本研究中選擇F2群體中抗感極端材料各20株構建白粉病抗感池。如圖2所示，在抗性池中，在第5染色體22—25 Mb區(qū)間SNP-index接近0，說明該位點與參考基因組序列基本一致；而在感病池中在同一區(qū)間SNP-index接近1，說明該位點與參考基因組序列存在序列差異。觀察兩個池在同一區(qū)間的 SNP-index值相減后得到Δ(SNP-index)數(shù)值，可以看出，22—25 Mb的Δ(SNP-index)值大于 0.5，并顯著大于0（P＜0.05）；15—20 Mb的Δ(SNP-index)值在0.25—0.35。由此，確認第五號染色體15—25 Mb區(qū)段為白粉病抗性基因的候選區(qū)域，將該基因暫命名為PM74。

圖2 抗感池SNP檢測結果Fig. 2 Detection results with SNP markers in the resistant (Br) and susceptible (Bs) bulks

2.3 抗性基因的精細定位

為了進一步定位PM74在5號染色體的位置，利用位于5號染色體的290個SSR標記、38個In/Del標記和12對PCR標記，共篩選獲得在抗感親本間存在多態(tài)性的23對SSR標記、10對In/Del標記和2對PCR標記，利用上述多態(tài)性標記對F2單株進行連鎖分析。結合F2單株抗病性表型分析，共預測到1個白粉病抗性相關QTL（PM74），位于標記SSR15321和SSR07531之間，遺傳距離為3.06 cM，LOD值21.99，可解釋41.95%的表型變異（圖3）。利用GUGI提供基因組數(shù)據(jù)，標記SSR15321位于5號染色體17 443 753—17 443 896位置；SSR07531位于5號染色體17 208 433—17 205 452位置，這與利用BSA混池測序鑒定的結果一致。最終將黃瓜抗白粉病基因PM74鎖定在5號染色體第17 443 896—17 205 452堿基之間，物理距離為238 444 bp。

2.4 候選基因的預測分析

結合Phytozome數(shù)據(jù)庫中的注釋數(shù)據(jù)及NCBI比對，在候選區(qū)段內(nèi)預測到17個有功能注釋的基因（圖3和表1）。這些基因編碼的蛋白類型包括MYB轉錄因子（Cucsa.275510）、植物自交不親和蛋白（Cucsa.275540和Cucsa. 275550）、PPR蛋白（Cucsa.275720）等。其中，還包含有一個TIR-NBS-LRR蛋白（Cucsa.275630）。

3 討論

MICHELNORE等[24]最早利用群體分離分析法（bulked segregant analysis）在萵苣中篩選到與抗病基因緊密連鎖的分子標記，簡稱BSA法。此后，BSA 法與不同類型的分子標記（RFLP、RAPD、SSR標記等）相結合，廣泛地應用于作物重要農(nóng)藝性狀的關鍵基因定位研究中，顯示出巨大的應用潛力和發(fā)展前景[25]。近年來，測序技術的快速發(fā)展，也隨之產(chǎn)生了基于全基因組重測序的BSA-seq技術。BSA-seq技術將基因組測序技術與極端性狀個體 DNA混池有機結合，使基因定位克隆又迎來了一個新的階段[26]。本研究構建了各包含20個單株的抗、感池，通過基因組重測序獲得5 Gb的序列，將候選基因初步定位于黃瓜5號染色體的15—25 Mb處。

目前，在黃瓜白粉病抗性基因QTL的定位研究上已經(jīng)有大量的報道，張桂花等[3]利用F2分離群體，通過構建抗感池，獲得一個AFLP標記，與黃瓜的白粉病抗性基因連鎖，遺傳距離為5.56 cM。簡德明[7]獲得與黃瓜白粉病感病基因連鎖的 AFLP標記（P63M51-384）和SCAR標記（PMSCAR-300），連鎖距離均為7 cM。此外，還有利用SSR標記開展抗性基因定位的研究，張海英等[27]獲得 2 個與黃瓜白粉病主效抗病基因連鎖的SSR分子標記SSR97-200和SSR273-300，連鎖遺傳距離分別為5和13 cM。此外，聶京濤等[28]研究認為SSR標記SSR15592與黃瓜白粉病基因緊密連鎖，且與抗性基因的遺傳距離為7.62 cM。SSR連鎖標記的獲得也使得開展黃瓜白粉病分子育種成為可能。同樣，在黃瓜白粉病研究中也有大量關于QTL定位的研究報道，例如張圣平等[13]檢測到1個白粉病的抗性基因的QTL位點，其中位于5號染色體的pm5.2位點的效應最強。XU等[29]在 1號染色體上檢測到1個白粉病抗性基因QTL位點Pm1.1，位于S6472和SSR16881之間，物理距離為41.1 kb，在該區(qū)段預測到8個候選基因。XU等[30]在5號染色體上發(fā)現(xiàn)了與Pm5.1抗性有關的8個候選基因，包括編碼受體蛋白激酶基因、轉錄因子和熱激蛋白基因等。值得注意的是，多數(shù)白粉病抗性基因定位在5號染色體。本研究中，PM74基因定位于5號染色體SSR07531和SSR15321標記之間，物理距離為238 444 bp，包含一個TIR-NBS-LRR Like基因。

圖3 黃瓜白粉病抗性基因精細定位Fig. 3 Fine mapping of powdery mildew resistance gene in cucumber

表1 候選區(qū)段基因信息Table 1 Gene information in the candidate regions

NBS是一類非常重要的抗病基因，在其他作物中有大量報道的抗性基因屬于NBS類基因，例如小麥抗條銹病基因Yr10（CC-NBS-LRR），小麥抗稈銹病基因Sr33（CC-NBS-LRR），大麥中白粉病基因Mla1（CC-NBS-LRR），亞麻中的銹病基因L6（TIR-NBS-LRR）和M（TIR-NBSLRR）[31-35]。而黃瓜中也有關于NBS類基因的報道，張圣平在5號染色體上定位到的白粉病抗性基因候選區(qū)段包含4個NBS類抗病基因[13]，依據(jù)標記信息比對基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PM74所在區(qū)段與張圣平等[13]所定位的基因并不在同一個scaffold，初步認定PM74是不同于其所定位的基因。同樣，NIE等[36]定位的基因是位于scaffold000038，與PM74也不在同一個scaffold。初步認為PM74是位于5號染色體的一個新的抗性基因，還需要進一步的試驗驗證。

4 結論

在黃瓜‘74’自交系的5號染色體15—25 Mb處檢測到一個貢獻率為41.95%的白粉病抗性基因，初步命名為PM74。該抗性基因位于SSR15321和SSR07531之間，遺傳距離為3.06 cM，物理距離為238 444 bp。該預測候選區(qū)段內(nèi)包含有 17個基因，其中 Cucsa.275630為TIR-NBS-LRR類基因。