趙青青，李俊平，梁立濱，黃山雨，周陳陳，趙玉輝，王倩，周圓，姜麗，陳化蘭，李呈軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069）

0 引言

【研究意義】流感病毒（influenza virus）是引起流行性感冒的重要病原體，在人群中傳播可造成季節(jié)性流感以及流感大流行，嚴(yán)重危害人類的健康[1-3]。目前對(duì)于流感病毒的防控措施主要有疫苗免疫和抗流感藥物。由于流感病毒基因組包含 8條單股負(fù)鏈 RNA片段，極易發(fā)生重組和突變[4-6]，使得疫苗和抗流感藥物失去保護(hù)作用。因此，研究流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制及調(diào)控機(jī)制可以為防控流感病毒提供新思路。在病毒入侵宿主過(guò)程中，病毒組分與宿主蛋白發(fā)生廣泛且復(fù)雜的相互作用。PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶復(fù)合體的重要組成部分，在流感病毒 RNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。因此研究 PA蛋白與宿主蛋白的相互作用對(duì)于揭示流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制及調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PA蛋白由流感病毒基因組第3節(jié)段編碼，全長(zhǎng)為716個(gè)氨基酸，具有核定位信號(hào)[8]。在流感病毒粒子中，PA與PB2和PB1組成RNA聚合酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9-10]。PA蛋白經(jīng)胰酶切割后可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域[11]，氨基端結(jié)構(gòu)域具有切割宿主mRNA前體分子5′帽子結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核酸酶活性[12]，羧基端的突變可使 RNA聚合酶復(fù)合體失去轉(zhuǎn)錄活性[13]。此外，PA蛋白具有蛋白水解活性[14]，還是酪氨酸激酶II的底物，可以發(fā)生絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化[15]。已發(fā)現(xiàn)與PA蛋白相互作用的蛋白有：IRF3[16]、MCM[17]、COPI[17]、HAX1[18]、CLE[19-20]、FACT[19]等。【本研究切入點(diǎn)】鑒于PA蛋白在流感病毒 RNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程中的重要功能，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù)從cDNA文庫(kù)中篩選與PA蛋白相互作用的宿主蛋白，獲得多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1（poly（rC）-binding protein 1，PCBP1）。已有研究表明，PCBP1蛋白與豬繁殖障礙呼吸綜合征病毒（PRRSV）[21]、豬瘟病毒（CSFV）[22]以及人類免疫缺陷性病毒（HIV）[23]的復(fù)制有關(guān)，且PCBP1蛋白對(duì)不同病毒復(fù)制的調(diào)控作用具有多樣性，目前尚未有關(guān)于PCBP1蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制影響的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索PA蛋白與PCBP1蛋白的相互作用關(guān)系以及PCBP1蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制的影響，為深入理解流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制及調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.1 主要試驗(yàn)材料

真核表達(dá)載體 pCAGGS由美國(guó)威斯康星大學(xué)Yoshihiro Kawaoka教授惠贈(zèng)； pGADT7-DEST酵母雙雜交文庫(kù)由Invitrogen構(gòu)建；siRNA由蘇州吉瑪基因公司合成；Flag、Myc等標(biāo)簽抗體均購(gòu)自Sigma-Aldrich；兔抗 PA多抗為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；小鼠抗PCBP1單抗購(gòu)自Abcam；IRDye800CW山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG購(gòu)自LI-COR Bioscience；流感病毒 A/Anhui/2/2005（H5N1）、A/WSN/1933（H1N1）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 酵母回交驗(yàn)證

采用LiAc方法[24]將陰性對(duì)照組pGBKT7-Lamin+pGADT7-T、陽(yáng)性對(duì)照組pGBKT7-p53+pGADT7-T和誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-PA+重組陽(yáng)性質(zhì)粒 pGADT7-PCBP1三組質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞，把轉(zhuǎn)化后的菌液分別涂布在 SD/-2、SD/-4和SD/-4/X/A三種營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上，30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5—7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況及顏色。

1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

參照GenBank中登錄的A/Anhui/2/2005（H5N1）病毒 PA基因序列（GenBank: HM172310.1）及人源PCBP1 序列（poly（rC）binding protein 1 [Homo sapiens（human）] Gene ID: 5093），設(shè)計(jì)相關(guān)克隆引物（表1）。Trizol法[25-26]提取流感病毒RNA，經(jīng)12 bp通用引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用PA特異性擴(kuò)增引物，從流感病毒cDNA中擴(kuò)增出PA片段，與NdeI/SmaI雙酶切處理的pCAGGS載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-Flag-PA；根據(jù)QIAGEN的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取A549細(xì)胞總RNA，以oligo（d）T為引物反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，利用PCBP1特異性擴(kuò)增引物擴(kuò)增 PCBP1目的基因，將載體 pCAGGS進(jìn)行EcoRI/SmaI雙酶切處理，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pCAGGSMyc-PCBP1。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 免疫共沉淀試驗(yàn)

將HEK293T細(xì)胞按1∶4傳代于賴氨酸包被的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約 80%時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX with Plus Reagent（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)，將真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGSMyc-PCBP1各1 μg配制單轉(zhuǎn)和共轉(zhuǎn)混合液，室溫靜置25 min，然后將HEK293T細(xì)胞用PBS洗一遍后每孔加入500 μL opti-MEM培養(yǎng)基，然后加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)染混合液，8—12 h后更換正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入 200 μL含 Protease Inhibitor Cocktail（Roche）的NP40裂解液，在冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min并收集上清，取1/10樣品留作裂解液對(duì)照Input，剩余樣品經(jīng)加入1μL小鼠抗FLAG 單抗 4℃結(jié)合4—6 h、加入30 μL Protein G瓊脂糖珠（Roche）4℃結(jié)合 4—6 h、預(yù)冷裂解液（含PMSF）洗4—6次、加入30 μL 2×蛋白上樣緩沖液后95℃煮5 min等一系列過(guò)程制備IP樣品。將得到的Input和IP樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h、5%脫脂乳室溫封閉1 h、兔抗Myc多抗和兔抗 FLAG多抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育 1 h、0.05%PBST洗3遍、IRDye800CW山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育1 h、0.05%PBST洗3遍，然后利用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI-COR公司）掃膜。

1.5 流感病毒蝕斑滴定

將MDCK細(xì)胞接種于12孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到95%時(shí)進(jìn)行蝕斑滴定。配制2×MEM培養(yǎng)基（含0.6%BSA，1 μg·mL-1TPCK 胰酶），用等體積 ddH2O 將2×MEM 培養(yǎng)基稀釋為 1×MEM 培養(yǎng)基，并分裝于1.5 mL離心管，每管900 μL，取100 μL病毒液進(jìn)行倍比稀釋。將12孔板中的MDCK細(xì)胞用PBS洗兩遍，然后每孔加入100 μL倍比稀釋后的病毒液，感染1 h。然后棄病毒液，每孔加入1 mL固態(tài)培養(yǎng)基（2×MEM培養(yǎng)基、等體積的 2%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠），待培養(yǎng)基凝固后，倒置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后用福爾馬林固定液固定。固定后，棄孔中固態(tài)培養(yǎng)基，以0.1%結(jié)晶紫溶液染色，空斑計(jì)數(shù)。應(yīng)用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行Multiple t tests分析。

1.6 PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)病毒復(fù)制的影響

參照慢病毒包裝系統(tǒng) pLVX-IRES-ZsGreen1（Clontech）說(shuō)明書(shū)，將pLVX-IRES-ZsGreen1空載體或 pLVX-IRES-ZsGreen1-PCBP1、pSPAX2和 pMDG按4∶3∶1共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝假病毒，48 h后收獲上清，將包裝的病毒侵染A549細(xì)胞，被假病毒侵染的A549細(xì)胞將表達(dá)綠色熒光蛋白ZsGreen1，48 h后將A549細(xì)胞消化成單細(xì)胞根據(jù)熒光標(biāo)記進(jìn)行超速流式細(xì)胞分選，留下陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，建立PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)A549的細(xì)胞系，并通過(guò)Western blot驗(yàn)證PCBP1蛋白的過(guò)表達(dá)情況。將A/WSN/1933（H1N1）毒株以MOI=0.01感染對(duì)照組及PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)A549細(xì)胞系，并分別于感染后24、48 h收獲上清，進(jìn)行蝕斑滴定計(jì)數(shù)。

1.7 PCBP1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)病毒復(fù)制的影響

參照Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)，將 Scramble siRNA和 PCBP1 siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h以MOI=0.01感染A/WSN/1933（H1N1），并于感染后24、48 h收上清進(jìn)行蝕斑滴定計(jì)數(shù)，同時(shí)收獲細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)干擾效果。

2 結(jié)果

2.1 酵母回交驗(yàn)證

將陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和 pGADT7-PCBP1+pGBKT7-PA 3組酵母質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化Y2H感受態(tài)細(xì)胞后涂在SD/-2、SD/-4和SD/-4/X/A 3種營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組 pGBKT7-Lamin+pGADT7-T可以在SD/-2平板上生長(zhǎng)，但不能在SD/-4、SD/-4/X/A平板上生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照組 pGBKT7-p53+pGADT7-T在3種缺陷型平板上均能正常生長(zhǎng)，而且陽(yáng)性對(duì)照組可以分解SD/-4/X/A平板的X-α-Gal，使菌落變藍(lán)，表明陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常。重組陽(yáng)性質(zhì)粒pGADT7-PCBP1+pGBKT7-PA也可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A 3種營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，并且也能分解底物X-α-Gal，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色（圖1），與陽(yáng)性對(duì)照組一致，表明PA蛋白與PCBP1蛋白在酵母系統(tǒng)中存在相互作用。

圖1 酵母回交驗(yàn)證PA蛋白與PCBP1蛋白的相互作用Fig. 1 Interaction between PA protein and PCBP1 protein in yeast

2.2 PA蛋白與PCBP1蛋白互作的Co-IP驗(yàn)證

將pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞。細(xì)胞裂解液樣品（Input）結(jié)果顯示， PA蛋白和PCBP1蛋白均正常表達(dá)，Co-IP結(jié)果顯示PA蛋白與PCBP1蛋白之間存在相互作用，而PA蛋白與pCAGGS空載體不存在相互作用（圖2）。

2.3 過(guò)表達(dá)PCBP1蛋白抑制流感病毒復(fù)制

利用慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1包裝假病毒，侵染A549細(xì)胞后經(jīng)流式分選構(gòu)建PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。取部分細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，證實(shí)PCBP1蛋白在A549過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中表達(dá)量顯著上調(diào)（圖3-A）。同時(shí)，將A/WSN/1933（H1N1）毒株以MOI=0.01感染A549過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系，收上清后進(jìn)行蝕斑滴定檢測(cè)病毒復(fù)制情況。結(jié)果顯示，感染后48 h病毒滴度下降，P＜0.01，差異極顯著，說(shuō)明PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)后可以抑制流感病毒的復(fù)制（圖3-B）。

2.4 PCBP1蛋白表達(dá)下調(diào)后促進(jìn)流感病毒的復(fù)制

將 Scramble siRNA和 PCBP1 siRNA分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，確證PCBP1蛋白表達(dá)水平下降（圖 4-A）。同時(shí)，以 MOI=0.01 A/WSN/1933（H1N1）病毒感染后，利用蝕斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒復(fù)制情況。結(jié)果顯示，感染后48 h病毒滴度升高，P＜0.01，差異極顯著（圖 4-B），表明 PCBP1蛋白表達(dá)下調(diào)后促進(jìn)病毒復(fù)制。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是高通量篩選和鑒定蛋白互作的有效方法[27]，廣泛應(yīng)用于篩選與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白。由于流感病毒基因組較小，蛋白編碼能力有限，因此在病毒感染宿主的過(guò)程中會(huì)與大量的宿主蛋白發(fā)生相互作用。筆者前期利用酵母雙雜交技術(shù)從人源細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選到與流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白PCBP1。PCBP1是一種RNA結(jié)合蛋白，因其可以與 RNA多聚胞嘧啶區(qū)域特異性結(jié)合而得名。PCBP1基因在1994年由AASHEIM等從人淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)[28]，屬于多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白PCBPs家族成員之一，因其含有3個(gè)與該家族最先被發(fā)現(xiàn)的成員hnRNP K（heterogenous nuclear ribonucleoprotein K）相似的 KH結(jié)構(gòu)域（hnRNP K homology, KH domain），因此又被命名為 hnRNP E1[29]。PCBP1蛋白廣泛表達(dá)于人體各組織器官，在多水平參與基因的表達(dá)調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄、前體mRNA剪切、mRNA穩(wěn)定性、翻譯沉默或翻譯增強(qiáng)及蛋白質(zhì)之間相互作用等[29-30]。PCBP1含有核定位信號(hào)[31]，具有核-質(zhì)穿梭特性[32]。有研究表明，PCBP1及PCBP2可與豬繁殖障礙呼吸綜合征病毒（PRRSV）的NS 1β蛋白互作，促進(jìn)PRRSV的復(fù)制[21]；PCBP1與豬瘟病毒（CSFV）的Npro蛋白互作，PCBP1對(duì)豬瘟病毒具有正調(diào)控作用[22]。在人類免疫缺陷性病毒HIV的研究中發(fā)現(xiàn)，PCBP1可以同HIV的外顯子剪接抑制子3（exon splicing silencer 3，ESS3）區(qū)域相互作用，且對(duì)病毒復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用[23]。可見(jiàn)，PCBP1蛋白對(duì)不同病毒復(fù)制的調(diào)控作用具有多樣性。目前也有許多研究報(bào)道PCBP1與人類多種腫瘤發(fā)生如結(jié)腸癌、乳腺癌及宮頸癌等具有相關(guān)性[33-35]。PCBP1功能的多樣性可能是由于其參與不同的通路或形成不同的復(fù)合體，從而對(duì)mRNA穩(wěn)定性及蛋白翻譯過(guò)程影響不同。

圖2 Co-IP 驗(yàn)證PA蛋白與PCBP1蛋白相互作用Fig. 2 Verification of interaction between PA protein and PCBP1 protein by Co-IP assay

圖3 過(guò)表達(dá)PCBP1 抑制流感病毒復(fù)制Fig. 3 Inhibition of influenza virus replication in PCBP1-overexpressing A549 cells

圖4 敲低PCBP1促進(jìn)流感病毒復(fù)制Fig. 4 Knockdown of PCBP1 in A549 cells promotes influenza virus replication

本研究通過(guò)酵母回交驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)了 PCBP1蛋白與流感病毒PA蛋白在酵母系統(tǒng)中存在相互作用。由于酵母雙雜交系統(tǒng)假陽(yáng)性率較高，且蛋白質(zhì)在酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的加工修飾不完全相同，因而蛋白質(zhì)在酵母中的相互作用并不一定反應(yīng)真實(shí)情況。本研究采用免疫共沉淀檢測(cè)流感病毒PA蛋白與PCBP1蛋白在HEK293T細(xì)胞中相互作用，發(fā)現(xiàn)PA蛋白可以與PCBP1蛋白發(fā)生免疫共沉淀，說(shuō)明PA蛋白與PCBP1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)利用慢病毒過(guò)表達(dá)系統(tǒng) pLVX-IRES-ZsGreen1將 A549細(xì)胞中PCBP1蛋白過(guò)表達(dá)，可以抑制流感病毒復(fù)制，而通過(guò) siRNA干擾下調(diào)A549細(xì)胞中PCBP1蛋白表達(dá)后，可以促進(jìn)流感病毒復(fù)制，即PCBP1蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制具有負(fù)調(diào)控作用，但其調(diào)控流感病毒復(fù)制的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)流感病毒PA蛋白與宿主蛋白PCBP1在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在相互作用，且宿主蛋白PCBP1對(duì)流感病毒復(fù)制具有負(fù)調(diào)控作用。