張曉晗， 萬 甜， 程 文， 王 敏， 任杰輝

(西安理工大學(xué) 西北旱區(qū)生態(tài)水利工程國家重點實驗室培育基地， 陜西 西安 710048)

1 研究背景

喹諾酮類和磺胺類抗生素均是由人工合成的抗生素，具有廣譜抗菌性、強抗菌活性的特點，已廣泛應(yīng)用于人類疾病防治、畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1-2]。研究表明，我國抗生素使用量已達到4 104 t，占世界比例的20%，而喹諾酮類以及磺胺類抗生素是使用頻次最高、水體中殘留量最大的兩類抗生素[3]。朱琳等[4]發(fā)現(xiàn)北京市清河水體主要污染物質(zhì)是中喹諾酮類抗生素，平均值為2238.9 ng/L。金磊等[5]發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)某水源水中磺胺的檢出頻率為100%，濃度為43.1 ng/L。目前，有關(guān)抗生素對淡水綠藻的影響研究已經(jīng)取得一定的進展。秦宏偉等[1]研究了氧氟沙星對斜生柵藻毒性作用，發(fā)現(xiàn)不同濃度的OFLX對斜生柵藻的生長均受到抑制且EC50值隨著時間延長逐漸增大。劉濱揚[3]研究紅霉素、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑?qū)ρ蚪窃卵涝宓亩拘孕?yīng)，發(fā)現(xiàn)紅霉素對羊角月牙藻毒性更強。

綠藻作為水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者[6]，是監(jiān)測評價水環(huán)境質(zhì)量和污染物生態(tài)毒性的重要指示生物[7]，在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定狀態(tài)過程中扮演者十分重要的角色[8],當(dāng)這些抗生素存在于水體中時，會影響綠藻的生命代謝活動，從而影響綠藻的生長和生理活性[9]。葉綠素是評價藻類等浮游生物的生產(chǎn)力的重要指標，如四環(huán)素類對藻細胞中葉綠素a含量具有抑制效應(yīng)，而青霉素對藻細胞葉綠素產(chǎn)生“低促高抑”的影響。研究表明，藻類是污染物毒性試驗中理想的生物體，其生長狀況以及生理生化特性的變化可以有效地反映出抗生素對它們的影響[10-11]。

本研究以蛋白小球藻、斜生柵藻兩種綠藻為試驗對象，分析了氧氟沙星(喹諾酮類)、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺二甲基嘧啶(磺胺類抗生素)等3種抗生素在單一及聯(lián)合條件下對綠藻的敏感性，定量計算抗生素對綠藻的半抑制濃度，以期為全面認識喹諾酮類、磺胺類抗生素對綠藻的毒理作用，為抗生素類藥物的生態(tài)風(fēng)險評價及水體富營化提供參考價值。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

供試普通小球藻(C. vulgaris)、斜生柵藻(S. obliquus)購自中國科學(xué)院水生生物研究所，試驗所用氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)和磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonoethoxine，SMM)兩種抗生素，購自北京百靈威科技有限公司，其純度分別大于98%、95%，磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SMZ)抗生素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其純度大于99%。

2.2 藻細胞的預(yù)培養(yǎng)

在無菌條件下將5 mL藻種接種至10 mL BG11培養(yǎng)基中，于PRX-350B型智能人工氣候箱中恒溫光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并進一步擴大培養(yǎng)。將處于對數(shù)增長期的15 mL藻種接種于裝有75 mL培養(yǎng)基(1∶5)的錐形瓶中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，光暗比 12 h∶12 h，光照2 000 Lux靜置培養(yǎng)，每天定時搖動3～4次，以減少藻細胞貼壁現(xiàn)象。培養(yǎng)一段時間后，鏡檢細胞正常，進入對數(shù)增長期開始試驗。

2.3 藻類指標的測定

將處于對數(shù)增長期的普通小球藻、斜生柵藻分別接種到100 mL的錐形瓶中，試驗初始藻細胞濃度為12×106個/mL，總體積90 mL，加入不同濃度梯度的抗生素(抗生素濃度見表1)。抽取 65μL(55 μL培養(yǎng)基+5 μL抗生素+5 μL藻液)的培養(yǎng)液于分光光度計(酶標儀)上測定在600 nm處的吸光度OD600，每天測定培養(yǎng)液的藻細胞濃度，做6組平行測定，在接種后分別觀察0、24、48和96 h的吸光度OD600， 以細胞干物質(zhì)重計的細胞濃度計算為：

CDW=OD600×0.4

(1)

式中：CDW為細胞干重，g/L。

表1用于敏感性試驗的抗生素濃度 μg/mL

2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用Origin9.1軟件中非線性最小二乘擬合(NLSF)進行統(tǒng)計分析，單因素方法分析綠藻對不同濃度抗生素的敏感性。同時使用非線性函數(shù)模型對藻細胞第96 h生長抑制數(shù)據(jù)進行非線性擬合，進而求得各個擬合模型的相關(guān)參數(shù)。求得抗生素對藻類的半抑制濃度，定量分析抗生素對綠藻生長的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 單一抗生素對綠藻生長的影響

3.1.1 OFLX對綠藻生長的影響 OFLX對普通小球藻、斜生柵藻生長的影響試驗結(jié)果如圖1。 OFLX對普通小球藻和斜生柵藻生長均表現(xiàn)出“低促高抑”，在1～5 μg/mL的OFLX作用下，細胞干重大于對照組，表明綠藻的生命活性指數(shù)增加，生長狀況良好，對綠藻的生長起促進作用，隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞干重增量越來越小，促進作用趨于平穩(wěn)；反之，當(dāng)OFLX濃度≥5 μg/mL時，細胞干重低于對照，對綠藻的生長起抑制作用，濃度越大，抑制作用越顯著，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞干重變化越來越小，抑制率下降，10 μg/mLOFLX培養(yǎng)后兩種藻類細胞干重相比對照組分別減少了13.4%、5.8%，表明OFLX對斜生柵藻更為敏感。

圖1 氧氟沙星對藻類生長的影響

綠藻在第96 h已經(jīng)達到生長階段的穩(wěn)定期。故用第96 h的細胞生長數(shù)據(jù)分析抗生素抑制濃度，得到藻細胞濃度與抗生素濃度關(guān)系曲線。

擬合所得的普通小球藻對OFLX敏感性曲線表達式為：

Y=-0.0013X2+0.0105X+0.0794

(2)

(R2=99.13%)

取對照組生長量的一半Y=1/2Y=0.08057，求得半抑制濃度為，X1/2=7.96 μg/mL，即OFLX對普通小球藻的半抑制濃度為7.96 μg/mL。

擬合所得的斜生柵藻對OFLX敏感性曲線表達式為：

Y=-0.0002X2+0.0013X+0.0782

(3)

(R2=95.95%)

取對照組生長量的一半Y=1/2Y=0.07857，求得半抑制濃度為，X1/2=6.20 μg/mL，即OFLX對斜生柵的半抑制濃度為6.20 μg/mL。

分析OFLX對藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對OFLX更為敏感。

3.1.2 SMM對藻類生長的影響 SMM對普通小球藻、斜生柵藻生長的影響實驗結(jié)果如圖2。當(dāng)SMM濃度為1 μg/mL，藻類的細胞干重在整個處理期內(nèi)與對照組無顯著差異，說明藻類可以耐受1 μg/mL的SMM，3、5 μg/mL的SMM處理藻類其細胞干重顯著高于對照組，隨后增量變小，促進作用不明顯，在第48 h，濃度為5 μg/mL的SMM的處理下兩種藻類相比對照組增加了19.6%、27.9%，7、10 μg/mL的SMM處理細胞干重低于對照組，但始終呈增加趨勢，在第72 h、7 μg/mL的SMM培養(yǎng)的斜生柵藻細胞干重突增，隨后又顯著下降，10 μg/m LSMM培養(yǎng)后細胞干重相比對照組分別減少了12.1%、16.9%，表明SMM對普通小球藻更為敏感；SMM對普通小球藻和斜生柵藻生長均表現(xiàn)出“低促高抑”。

圖2 磺胺間甲氧嘧啶對藻類生長的影響

取圖2中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對SMM敏感性曲線表達式分別為式(4)和式(5)。

Y=-0.0002X2+0.0011X+0.0486

(4)

(R2=91.67%)

Y=-0.0005X2+0.0036X+0.0520

(5)

(R2=91.64%)

求得SMM對普通小球藻的半抑制濃度為6.58 μg/mL；SMM對斜生柵藻的半抑制濃度為7.20 μg/mL。分析SMM對藻類的半抑制濃度可知，普通小球藻對SMM更為敏感。

3.1.3 SMZ對藻類生長的影響 SMZ對普通小球藻、斜生柵藻生長的影響實驗結(jié)果如圖3。1～5 μg/mL的SMZ在開始培養(yǎng)藻細胞的細胞干重就顯著高于對照組，濃度越高，細胞干重增加越多，對藻類生長的促進作用越明顯，在第24 h時5 μg/mL的SMM處理的藻類相比對照組增加了30.4%、13.0%，隨著時間的延長增速趨于穩(wěn)定，7～10 μg/mL 的SMZ在處理后細胞干重就開始下降，且下降程度與濃度呈正相關(guān)，從整體來看隨著時間的延長細胞干重在少量增加，抗生素不僅抑制藻類生長，對藻細胞產(chǎn)生毒性，而且能改變其形態(tài)結(jié)構(gòu)，通過藻細胞的組織結(jié)構(gòu)進一步抑制藻細胞的分裂和生長繁殖；SMZ對普通小球藻和斜生柵藻生長均表現(xiàn)出“低促高抑”。

圖3 磺胺二甲基嘧啶對藻類生長的影響

取圖3中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對SMZ敏感性曲線表達式分別為公式(6)和公式(7)。

Y=-0.0004X2+0.0035X+0.0396

(6)

(R2=94.39%)

Y=-0.0003X2+0.003X+0.0407

(7)

(R2=90.55%)

求得SMZ對普通小球藻的半抑制濃度為8.19 μg/mL；SMZ對斜生柵藻的半抑制濃度為9.89 μg/mL。分析SMM對藻類的半抑制濃度可知，普通小球藻對SMZ更為敏感。

研究表明[1]OFLX對斜生柵藻的影響隨著暴露濃度的增大，斜生柵藻對OFLX生長的抑制作用不斷增強，藻細胞分解隨著受試物濃度的增加逐漸增多。萬禁禁[12]研究發(fā)現(xiàn)低濃度抗生素(小于1 μg/L和10 mg/L)作用下，綠藻的抗氧化系統(tǒng)無明顯變化，高濃度抗生素作用下，綠藻抗氧化酶活性受到誘導(dǎo)，丙二醛含量顯著增加，藻的生長受到抑制。與本實驗結(jié)論相一致。

3.2 聯(lián)合抗生素對綠藻生長的影響

3.2.1 兩種聯(lián)合抗生素(OFLX+SMM)對藻類生長的影響 OFLX+SMM抗生素對普通小球藻、斜生柵藻生長的影響實驗結(jié)果如圖4。由圖4可看出，聯(lián)合抗生素作用下，各濃度抗生素對藻細胞的細胞干重變化趨勢趨與對照組相似，1、7 μg/mL 的聯(lián)合抗生素對藻細胞的細胞干重相比對照組無太大變化，3、5 μg/mL 的抗生素作用下，藻細胞的細胞干重高于對照組，產(chǎn)生一定的促進作用，10 μg/mL的抗生素作用下，細胞干重稍有減少，產(chǎn)生輕微的抑制作用， OFLX+SMM對普通小球藻和斜生柵藻生長均表現(xiàn)出“低微促高輕抑”現(xiàn)象。相比單一抗生素，聯(lián)合抗生素對綠藻的作用較為溫和，高濃度抗生素對綠藻的抑制作用較差。

方章順等[13]研究表明，在毒性評價中，F(xiàn)C-30與SCP或TMP聯(lián)合時具有拮抗作用，對環(huán)境的影響小，同理，OFLX與SMM的濃度比1∶1時，其對綠藻的抑制作用較為溫和，小于單一抗生素的抑制率，OFLX+SMM對普通小球藻的半抑制濃度為8.28 μg/mL，大于單一抗生素對該藻類的半抑制濃度，表現(xiàn)為拮抗作用；對斜生柵藻的半抑制濃度為5.71 μg/mL，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

圖4 氧氟沙星+磺胺間甲氧嘧啶對藻類生長的影響

取圖4中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(OFLX+SMM)敏感性曲線表達式為公式(8)和公式(9)：

Y=-0.0002X2+0.0019X+0.0483

(8)

(R2=95.84%)

Y=-0.0001X2+0.001X+0.0459

(9)

(R2=99.09%)

求得(OFLX+SMM)對普通小球藻的半抑制濃度為8.28μg/mL；(OFLX+SMM)對斜生柵藻的半抑制濃度為5.71μg/mL。分析聯(lián)合抗生素對藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對OFLX+SMM更為敏感。

3.2.2 3種聯(lián)合抗生素(OFLX+SMM+SMZ)對藻類生長的影響 OFLX+SMM+SMZ抗生素對普通小球藻、斜生柵藻生長的影響實驗結(jié)果如圖5。由圖5可看出，低濃度抗生素在培養(yǎng)初期與對照組變化趨勢一致且高于對照組，對藻類生長具有良好的促進作用，隨著時間的延長，聯(lián)合抗生素對兩種藻類的促進作用越來越大，細胞干重增加越來越快，隨著抗生素濃度的增加，則產(chǎn)生抑制作用，細胞干重下降，且濃度越大，抑制作用越明顯，相比于兩種抗生素聯(lián)合具有很好的協(xié)同作用， OFLX+SMM+SMZ對普通小球藻和斜生柵藻生長均表現(xiàn)出“低促高抑”，表現(xiàn)出顯著地劑量-效應(yīng)的關(guān)系。聯(lián)合抗生素對普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL，表現(xiàn)為拮抗作用，對斜生柵的半抑制濃度為7.40 μg/mL，無明顯變化。

圖5 OFLX+SMM+SMZ對藻類生長的影響

取圖5中普通小球藻、斜生柵藻在第96 h的生長數(shù)據(jù)，擬合所得的普通小球藻和斜生柵藻對(OFLX+SMM+SMZ)敏感性曲線表達式分別為公式(10)和公式(11)：

Y=-0.0001X2+0.0009X+0.0508

(10)

(R2=97.28%)

Y=-0.0003X2+0.0022X+0.0466

(11)

(R2=95.79%)

求得聯(lián)合抗生素對普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL；聯(lián)合抗生素對斜生柵藻的半抑制濃度為7.40 μg/mL。分析聯(lián)合抗生素對藻類的半抑制濃度可知，斜生柵藻對OFLX+SMM+SMZ更為敏感。

4 結(jié) 論

本試驗以普通小球藻和斜生柵藻為試驗對象，研究了OFLX、SMM、SMZ 3種抗生素對兩種綠藻的生長的影響，探討抗生素對淡水微藻的作用機理，得出的結(jié)論為：

(1)OFLX、SMM、SMZ分別對普通小球藻的半抑制濃度分別為：7.96、6.58、8.19 μg/mL，SMM對普通小球藻的抑制力最強，敏感程度依次為：SMM>OFLX>SMZ。對斜生柵藻的半抑制濃度分別為：6.20、7.20、9.89 μg/mL，OFLX對斜生柵藻的抑制力最強，敏感程度為： OFLX>SMM>SMZ。

(2)當(dāng)OFLX+SMM兩種抗生素聯(lián)合，抑制率小于單一抗生素，其對普通小球藻的半抑制濃度為8.28 μg/mL,表現(xiàn)為拮抗作用；對斜生柵藻的半抑制濃度為5.71 μg/mL，表現(xiàn)為協(xié)同作用。當(dāng)OFLX+SMM+SMZ 3種抗生素聯(lián)合，對普通小球藻的半抑制濃度為10.23 μg/mL,表現(xiàn)為拮抗作用；對斜生柵藻的半抑制濃度為7.40 μg/mL。

(3)單一及聯(lián)合抗生素均對綠藻的生長表現(xiàn)為“低促高抑”?？股貪舛刃∮诘扔? μg/mL促進藻類的生長，濃度為5 μg/mL時促進作用最為明顯。隨著抗生素濃度增加，產(chǎn)生抑制作用，且OFLX對普通小球藻的促進作用和抑制作用均小于斜生柵藻。相反，SMM和SMZ對普通小球藻更為敏感。同OFLX一樣，聯(lián)合抗生素均對斜生柵藻更為敏感。