李維熙 ，劉冬麗，蘇薇薇，高永堅*

（1. 云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500；2. 中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；3. 國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305）

酸角（Tamarindus indicaLinn.），又名酸豆、羅望子，為蘇木科酸角屬植物，原產(chǎn)于非洲熱帶, 現(xiàn)在全世界熱帶、南亞熱帶地區(qū)均有廣泛引種和栽培[1]。我國云南、四川、海南、廣東、廣西、福建、臺灣等省均有大范圍種植。酸角在非洲、印度、孟加拉國、尼日利亞和巴基斯坦等國家作為傳統(tǒng)常用藥，使用歷史悠久[2]。在我國，酸角也被歷代醫(yī)藥典籍收載，據(jù)《本草綱目拾遺》記載“羅晃子味甘、性溫、止渴退熱，解利風邪”，《滇南本草》中也有“酸角味甘、性平。治酒化疾，隔于胃中”的說法。多項研究表明，酸角葉、果肉及種子提取物有較好的抗菌、抗真菌、退熱、止痛等活性[3]。目前，我國與酸角有關產(chǎn)品主要為普通飲料、糖果與糕點，開發(fā)利用程度較低。酸角殼為酸角食用和加工中的廢棄物，資源豐富，成本低廉，如能加以利用，將有巨大的開發(fā)潛質。

本文通過脂肪負荷模型探討酸角殼提取物對脂肪吸收的影響，并評價酸角殼提取物對腸道脂肪酶活性的抑制作用，旨在為開發(fā)酸角殼提供有益的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重200～240 g，SPF級，7周齡，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2014-0002。實驗動物按照美國NIH要求在清潔級層流架中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度22～24 ℃，照明時間12 h/d（6:00～18:00開燈）。適應性飼養(yǎng)1周后進行相關實驗。

1.2 試劑與材料

橄欖油（美國Sigma公司）；豬胰蛋白酶（美國Sigma公司）；4-甲基傘形酮（4-MU，美國Sigma公司）；考馬斯亮藍試劑盒，甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒及游離膽固醇（free cholesterol, FC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

MK3型酶標儀（芬蘭Labsystem公司）；Ultra-Turrax T8型組織勻漿機（德國IKA Labordchnik公司）；3-18K型臺式高速冷凍離心機（德國Sartorius公司）；BS210S電子分析天平（德國Sartorius公司）；WH-861型漩渦混合器（太倉科教器材廠）；超純水儀（德國Merck Millipore公司）；pHS-25型酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）；ZF-Ⅱ型紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.4 酸角殼提取物的制備

酸角采自云南西雙版納。準確稱取一定量，粉碎機粉碎后回收細粉化的酸角殼，加入10倍量50 %乙醇，加熱回流提取2 h，過濾，濾渣再用相同條件提取1次，合并兩次提取物濾液。濾液回收乙醇即得酸角殼提取物浸膏。

1.5 酸角殼提取物對脂肪負荷大鼠血脂的影響

實驗動物隨機分為模型組、酸角殼提取物100，200 mg/kg組，每組8只。于實驗開始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給藥，模型組灌胃給等體積蒸餾水。給藥30 min后，分別灌胃給予5 ml/kg橄欖油，并分別于橄欖油負荷前、負荷后于2，4，6，8 h經(jīng)尾靜脈取血，按照試劑盒說明測定TG、FFA、TC和FC水平[4]。

1.6 酸角殼提取物對大鼠小腸內脂肪酶活性的影響

實驗動物隨機分為模型組、酸角殼提取物100和200 mg/kg組，每組8只。于實驗開始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給藥，模型組灌胃給等體積蒸餾水。給藥30 min后，實驗動物經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后開腹，基于組織部位分析和實驗操作的需要，按小腸長度從上端起均分3等份剪開，即小腸上段、中段及下段3個部位，小腸上段為十二指腸及空腸上段，小腸中段為空腸中段和下段，小腸下段為回腸。分別將腸內容物取出，回收于特定容器中，取下小腸內黏膜并回收于特定容器。與預冷生理鹽水按1:9 比例制成勻漿，分別測定不同部位的小腸內黏膜及腸內容物中的胰脂肪酶活性，同時測定其蛋白質含量，并計算和比較同等蛋白質量中的酶活性及抑制率。抑制率計算公式：抑制率（%）=[(U模型-U給藥)/U模型]×100 %，其中U模型為模型組胰脂肪酶活性，U給藥為給藥組胰脂肪酶活性。

胰脂肪酶能以4-甲基傘形酮油酸酯（4-MU oleate)為底物，使其裂解并游離出油酸基團，其產(chǎn)物4-甲基傘形酮（4-MU）具有熒光性質，經(jīng)355 nm波長激發(fā)，在 460 nm處產(chǎn)生發(fā)射光，測定4-MU含量可用于表示胰脂肪酶的活性。將小腸內容物及內黏膜制成的組織勻漿，4 ℃，10000 r/min離心10 min，取上清加入濃度為50 μmol/L 的4-MU oleate DMSO溶液，室溫下反應30 min后，加入10.1 mol/L檸檬酸鈉溶液終止反應。在激發(fā)波長355 nm、發(fā)射波長460 nm下檢測4-MU的熒光強度。胰脂肪酶活性其中Finitial為反應起始時4-MU的熒光強度，F(xiàn)final為反應終止時4-MU的熒光強度，D為溶液稀釋倍數(shù)，T為反應持續(xù)時間，V為溶液體積[5]。

1.7 酸角殼提取物給藥后不同時間點對小腸脂肪酶活性的影響

實驗動物隨機分為模型組、給藥后0.5，1，2，3 h測定組，每組8只。于實驗開始前禁食12 h，各給藥組經(jīng)灌胃給予酸角殼提取物100 mg/kg，模型組灌胃給等體積蒸餾水。不同測定組于規(guī)定時間點，照1.7項方法分別取組織，測定不同部位的小腸內黏膜及腸內容物中的脂肪酶活性，同時測定其蛋白質含量[5]。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 酸角殼提取物對脂肪負荷大鼠血脂的影響

結果見表1～4。給予大鼠5 ml/kg橄欖油后，各組實驗動物TG水平明顯升高，均在負荷后6 h達到峰值，隨后逐漸下降，不同劑量的酸角殼提取物均能在一定程度上抑制TG值的上升，其中高劑量酸角殼提取物能顯著抑制橄欖油負荷后4 h和6 h的TG水平，TG波動幅度較小，餐后反應曲線比較平穩(wěn)。FFA是脂質代謝的中間體，在給予橄欖油之后，各組FFA水平均有所上升，與模型組相比，酸角殼提取物組并不能顯著升高FFA水平。

橄欖油負荷后，TC和FC水平無明顯變化，給予酸角殼提取物后對TC和FC水平也無顯著影響。

表1 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿TG的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表1 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿TG的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

組別 橄欖油負荷前 橄欖油負荷后2 h 橄欖油負荷后4 h 橄欖油負荷后6 h 橄欖油負荷后8 h模型組 0.27±0.06 1.35±0.19 2.75±0.14 3.12±0.25 2.18±0.31酸角殼提取物100 mg/kg組 0.24±0.05 0.96±0.21 2.01±0.38 2.48±0.54 1.72±0.32酸角殼提取物200 mg/kg組 0.45±0.04 0.72±0.18 1.34±0.35* 1.62±0.17** 1.68±0.66

表2 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿FFA的影響/μEq·L-1（± s，n=8）

表2 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿FFA的影響/μEq·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負荷前 橄欖油負荷后2 h 橄欖油負荷后4 h 橄欖油負荷后6 h 橄欖油負荷后8 h模型組 854.7±81.4 1360.0±292.3 1464.7±242.3 2102.3±595.1 2517.3±694.2酸角殼提取物100 mg/kg組 883.0±57.3 1439.4±332.5 2586.5±684.3 2535.2±211.2 2742.2±603.9酸角殼提取物200 mg/kg組 1032.4±55.6 1512.8±353.6 2611.8±949.9 2747.0±852.4 2188.2±502.9

表3 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿TC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表3 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿TC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負荷前 橄欖油負荷后2 h 橄欖油負荷后4 h 橄欖油負荷后6 h 橄欖油負荷后8 h模型組 1.50±0.12 1.51±0.15 1.53±0.16 1.58±0.15 1.59±0.21酸角殼提取物100mg/kg組 1.31±0.28 1.36±0.25 1.43±0.26 1.22±0.13 1.38±0.25酸角殼提取物200mg/kg組 1.50±0.22 1.53±0.14 1.58±0.09 1.59±0.06 1.53±0.10

表4 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿FC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

表4 酸角殼提取物對大鼠橄欖油負荷后不同時間點血漿FC的影響/mmol·L-1（± s，n=8）

組別 橄欖油負荷前 橄欖油負荷后2h 橄欖油負荷后4h 橄欖油負荷后6h 橄欖油負荷后8h模型組 0.33±0.01 0.33±0.02 0.35±0.01 0.40±0.02 0.45±0.04酸角殼提取物100mg/kg組 0.27±0.02 0.28±0.02 0.36±0.03 0.35±0.03 0.38±0.02酸角殼提取物200mg/kg組 0.32±0.01 0.31±0.02 0.38±0.02 0.39±0.03 0.37±0.02

2.2 酸角殼提取物對大鼠小腸內脂肪酶活性的影響

結果見表5～6。小腸內容物中的脂肪酶活性遠高于小腸黏膜中的脂肪酶活性，而小腸上段內容物中脂肪酶活性最高，不同劑量的酸角殼提取物對小腸內容物內的脂肪酶活性均有較強的抑制作用，并顯示明顯的量效關系，其中，100 mg/kg酸角殼提取物的脂肪酶抑制率為48 %，200 mg/kg酸角殼提取物的脂肪酶抑制率為72 %。

表5 酸角殼提取物對大鼠小腸黏膜中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

表5 酸角殼提取物對大鼠小腸黏膜中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

組別 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 3222.1±465.3 2211.2±433.1 1045.0±239.4酸角殼提取物100mg/kg組 2694.7±369.2 1325.2±262.7 852.9±202.4酸角殼提取物200mg/kg組 2757.5±334.1 1984.2±177.3 959.9±124.7

表6 酸角殼提取物對大鼠小腸內容物中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

表6 酸角殼提取物對大鼠小腸內容物中胰脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

組別 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 13341.1±839.4 3340.4±463.2 163.2±42.0酸角殼提取物100 mg/kg組 7646.1±594.5*1561.6±189.2* 133.1±46.3酸角殼提取物200 mg/kg組 4670.4±485.1**2127.9±597.7 150.5±85.4

2.3 酸角殼提取物給藥后不同時間點對小腸脂肪酶活性的影響

結果見表7～8。酸角殼提取物在給藥30 min和1 h后顯示較強的小腸脂肪酶的抑制作用，隨后抑制作用逐漸減弱，在給藥3 h后抑制作用基本消失。

表7 酸角殼提取物對大鼠小腸內黏膜中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

表7 酸角殼提取物對大鼠小腸內黏膜中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

注：*P＜0.05 vs 模型組

組別 給藥量/mg·kg-1 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 ─ 5498.0±447.0 2336.1±276.8 710.0±150.5給藥后30min 100 4342.0±603.2 1090.5±168.9*1311.7±324.4給藥后1 h 100 6475.0±754.6 2156.9±262.2 996.0±210.7給藥后2 h 100 6346.5±653.3 2360.4±248.5 1036.9±200.8給藥后3 h 100 5081.7±268.3 2784.0±371.6 1039.2±262.1

表8 酸角殼提取物對大鼠小腸內容物中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

表8 酸角殼提取物對大鼠小腸內容物中脂肪酶活性的影響/U·g-1蛋白質（± s，n=8）

注： **P＜0.01 vs 模型組

組別 給藥量/mg·kg-1 小腸上段 小腸中段 小腸下段模型組 ─ 27222.0±2393.1 10317.7±1724.21542.8±634.4給藥后30 min 100 5657.8±1000.6**2490.4±944.6**1311.7±349.9給藥后1 h 100 12530.5±1122.1**5039.0±631.5**1045.3±265.3給藥后2 h 100 15962.7±1939.7**6657.2±1270.3 1587.6±591.3給藥后3 h 100 20413.6±1495.9 9810.6±856.8 935.9±224.8

3 討論

本文結果表明，大鼠TG水平隨給予脂肪負荷上升，并在負荷后6 h達到峰值，而在脂肪負荷前后，各組實驗動物的TC與FC水平均無明顯變化。這可能是由于TG可源于食物中脂肪的吸收與分解，因此在給予脂肪負荷后，TG水平顯著升高；而TC和FC大部分來源于體內合成，受單次進食影響較小。與模型組比較，酸角殼提取物能降低脂肪負荷后不同時間點的TG水平，使餐后TG波動趨于平緩，提示酸角殼提取物能抑制餐后TG上升。

FFA是TG分解的中間體，給予脂肪負荷后，我們觀察到在TG水平上升同時，F(xiàn)FA水平隨之增加，但模型組與酸角殼提取物組之間的FFA水平無顯著性差異。酸角殼提取物在改善餐后TG水平的同時，不會顯著升高FFA水平，提示酸角殼提取物可能是通過抑制食物中脂肪水解吸收降低餐后TG水平。

胰脂肪酶能將食物中的脂肪水解，是食物中的脂肪在腸道消化吸收的關鍵酶之一。本實驗結果表明，酸角殼提取物能顯著抑制大鼠小腸胰脂肪酶活性，提示酸角殼提取物通過抑制胰脂肪酶阻礙食物中的脂肪水解和吸收，進而降低餐后TG水平。酸角殼提取物的胰脂肪酶抑制活性在給藥后30 min到1 h活性最強。

綜上所述，本文通過脂肪負荷模型探討了酸角殼提取物對餐后血脂的影響，同時評價了酸角殼提取物對胰脂肪酶活性的抑制活性，結果表明，酸角殼提取物能顯著降低脂肪負荷后各時間點的TG水平，并能顯著抑制小腸胰脂肪酶活性，提示酸角殼提取物通過抑制小腸胰脂肪酶活性，減少食物中脂肪的吸收，從而降低餐后TG水平。脂質代謝紊亂，特別是餐后脂質代謝紊亂常見于肥胖、高脂血癥、代謝綜合征和2型糖尿病，與這些疾病有著密切的關系[6]。同時，餐后血脂異常還對動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展起著尤為重要的作用[7]，特別是餐后高TG無論對于代謝異?；颊呋蛘Ｈ耍莿用}粥樣硬化以及心血管疾病的高風險因素[8-9]。隨著生活方式改變，人們的脂肪消費水平日漸增加，脂質代謝紊亂發(fā)病率也隨之上升。研究表明，餐后血脂異常早于空腹血脂異常出現(xiàn)，積極調節(jié)和治療餐后高甘油三酯血癥有助于改善代謝綜合征，并能預防動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生[10-11]。酸角殼是酸角果實食用和加工的副產(chǎn)物，來源豐富，目前尚未得到充分研究，具有較好的開發(fā)前景，同時，其作用機制也有待深入研究。