高翔 葉之華 戴玲 李瀚旻△

1.湖北省中醫(yī)院肝病研究所 (湖北 武漢， 430061) 2.湖北省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所 3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2016級博士研究生班

左歸丸是明代醫(yī)家張仲景的補腎名方，臨床應(yīng)用廣泛[1]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)左歸丸能夠促進骨髓干細胞轉(zhuǎn)化肝細胞，參與肝組織再生修復(fù)，并對其分子作用機制開展了一系列實驗研究[2～4]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討左歸丸復(fù)方制劑中的藥效活性成分多靶點、多層次協(xié)同作用調(diào)控肝再生的作用機制，闡釋“補腎生髓成肝”治療法則的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究策略 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)[5]和中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)[6]篩選左歸丸的藥效活性成分和潛在作用靶點，利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID)和KEGG通路數(shù)據(jù)庫(KEGG PATHWAY Database)分析靶點基因功能分類及其涉及的信號通路。利用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(STRING Database)構(gòu)建靶點基因編碼蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。

1.2 藥效活性成分—靶點預(yù)測 利用TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)搜索熟地黃、山茱萸、山藥、菟絲子、川牛膝、枸杞子、龜板膠、鹿角膠的有效成分，篩選出口服利用度(OB)≥30%且似藥性(DL)≥0.18的藥效活性成分并預(yù)測其潛在作用靶點，利用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)和HGNC人類基因名數(shù)據(jù)庫(https://www.genenames.org/)將潛在靶點轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)名稱(gene symbol)和檢索號(Ensemble Gene ID)。

1.3 靶點通路注釋分析 將潛在作用靶點的Ensemble Gene ID上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進行基因功能注釋(GO)富集分析和KEGG信號通路(KEGG pathway)富集分析，P<0.05為分析具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建靶點基因編碼蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，通過文本挖掘、實驗證據(jù)和數(shù)據(jù)庫挖掘并限定相互作用評分≥0.900篩選靶點基因編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，篩選相互作用評分≥0.995的關(guān)鍵靶點，并采用K均值聚類方法進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 左歸丸藥效活性成分—靶點的預(yù)測 通過檢索TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，篩選出槲皮黃酮、海風(fēng)藤酮、異鼠李素、谷甾醇類、山柰酚、豆甾醇、薯蕷皂苷元、亞麻酸乙酯、芝麻素、蓽茇寧酰胺、油酸乙酯、環(huán)阿屯醇、顛茄堿、山蒟酮、異巖藻酯醇等65個藥效活性成分，AKT1、BAX、BCL2、FOS、CDK2、EGF、GSK3B、IKBKB等靶點基因351個。

2.2 靶點基因功能注釋分析 以P<0.05且靶點數(shù)≥20為篩選原則，靶點基因主要涉及藥物反應(yīng)、乙醇應(yīng)答、凋亡過程及正負(fù)調(diào)控、細胞增殖及正負(fù)調(diào)控等28種生物學(xué)過程(見表1)，酶結(jié)合、藥物結(jié)合等15種分子功能(見表2)，以及質(zhì)膜、電壓門控鉀離子通道復(fù)合體等26種細胞組分(見表3)。

表1 左歸丸藥效成分靶點基因功能(生物學(xué)過程)聚類結(jié)果

表2 左歸丸藥效成分靶點基因功能(分子功能)聚類結(jié)果

表3 左歸丸藥效成分靶點基因功能(細胞組分)聚類結(jié)果

2.3 靶點基因-信號通路富集分析 靶點基因涉及144條信號通路，以P<0.05且靶點數(shù)≥20為篩選原則，靶點基因主要富集于癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1信號通路、TNF信號通路等32條信號通路見表4。

表4 左歸丸藥效成分靶點基因信號通路富集分析結(jié)果

2.4 關(guān)鍵靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)模型 左歸丸藥效成分靶點基因信號通路富集前5條通路包括81個靶點基因，通過文本挖掘、實驗證據(jù)和數(shù)據(jù)庫挖掘并限定相互作用評分≥0.900，靶點之間相互作用關(guān)系共計472條，PPI富集分析P<1.0×10-16，提示這群靶點基因編碼的蛋白質(zhì)具有一定程度上的生物學(xué)相關(guān)性，其中相互作用評分≥0.995的關(guān)鍵靶點有45個，K均值聚類方法將其分為2類(見表5)，其相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖1。

表5 左歸丸藥效成分—關(guān)鍵靶點蛋白K均值聚類分析結(jié)果

圖1 左歸丸藥效成分—關(guān)鍵靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型

3 討論

近年來，隨著計算機技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用和系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，系統(tǒng)藥理學(xué)這一新的研究領(lǐng)域進展迅速，它從藥物小分子、DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子、信號通路等多層次、多維度研究藥物與機體的相互作用方式，為理解中藥復(fù)方中復(fù)雜成分綜合發(fā)揮藥效作用的藥理機制提供了新的解決方案。國內(nèi)多個研究團隊開發(fā)了面向中藥研究的系統(tǒng)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、分析工具和平臺，為從系統(tǒng)水平闡明中藥復(fù)方作用機理、優(yōu)化組方配伍等提供了新的研究方法。本研究中主要使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)、中藥分子機制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)進行中藥復(fù)方藥效活性成分篩選和潛在作用靶標(biāo)預(yù)測。TCMSP整合了藥物代謝動力學(xué)、藥物化學(xué)和藥物-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)，包括2010版中藥藥典中的500味中藥所包含的化合物30069個，并提供用于藥物篩選和評價的藥代動力學(xué)性質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)，如口服生物利用度(OB)、小腸上皮通透性、似藥性(DL)、血腦屏障通透性、藥物半衰期、溶解度、藥物成藥五原則等，本研究以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為藥效成分篩選標(biāo)準(zhǔn)。此外，該數(shù)據(jù)庫通過模型預(yù)測和整合現(xiàn)有實驗數(shù)據(jù)預(yù)測了藥效活性成分的靶標(biāo)蛋白信息。

左歸丸出自《景岳全書》，滋陰補腎、填精益髓，主治真陰不足諸證。我們前期開展的體內(nèi)外實驗研究均發(fā)現(xiàn)左歸丸能夠促進骨髓干細胞轉(zhuǎn)化肝細胞、參與肝組織再生修復(fù)，體現(xiàn)了“補腎生髓成肝”的治療法則[7～9]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討左歸丸復(fù)方制劑中的藥效活性成分多靶點、多層次協(xié)同作用調(diào)控肝再生的作用機制，闡釋左歸丸治療肝臟病(肝病從腎論治)、發(fā)揮“補腎生髓成肝”治療作用的生物學(xué)基礎(chǔ)(療效機制)[10～16]。通過TCMSP和BATMAN-TCM平臺篩選出左歸丸復(fù)方中槲皮黃酮、海風(fēng)藤酮、異鼠李素、谷甾醇類、山柰酚、豆甾醇、薯蕷皂苷元、亞麻酸乙酯、芝麻素、蓽茇寧酰胺、油酸乙酯、環(huán)阿屯醇、顛茄堿、山蒟酮、異巖藻酯醇等65個藥效活性成分，圈定351個潛在作用靶標(biāo)，包括AKT1、BAX、BCL2、FOS、CDK2、EGF、GSK3B、IKBKB等，主要涉及藥物反應(yīng)、乙醇應(yīng)答、凋亡過程及正負(fù)調(diào)控、細胞增殖及正負(fù)調(diào)控等28種生物學(xué)過程，靶標(biāo)基因主要富集于癌癥相關(guān)通路、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1信號通路、TNF信號通路等32條信號通路，通過文本挖掘、實驗證據(jù)、數(shù)據(jù)庫挖掘和限定相互作用評分的方法篩選出45個關(guān)鍵靶點并構(gòu)建靶點間相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。上述結(jié)果提示，左歸丸治療肝臟病、發(fā)揮“補腎生髓成肝”作用的療效機制可能是其藥效活性成分通過靶基因-信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)藥物、乙醇及病毒因素等引起的肝組織應(yīng)答，動態(tài)調(diào)節(jié)肝組織細胞增殖/凋亡，多層次、多途徑實現(xiàn)減輕肝臟組織損傷、優(yōu)化肝臟再生修復(fù)。