黎運(yùn)呈 王 艷 王秋景 盛國(guó)光 高 莉△

1.浙江省舟山醫(yī)院感染科 (浙江 舟山， 316004) 2.湖北省中醫(yī)院

隨著目前飲食習(xí)慣的改變，脂肪肝的發(fā)病率逐年升高，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化等一系列變化[1～3]。肝臟是機(jī)體脂質(zhì)代謝的中心器官,也是內(nèi)源性和外源性脂肪代謝的交匯點(diǎn)和調(diào)節(jié)中樞,肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積是形成NAFLD的先決條件。山楂葉總黃酮(HLF)是從薔薇科植物山楂的干燥葉中提取的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山楂葉總黃酮具有降低血脂、抗氧化、降糖、抗血小板聚集等作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察山楂葉總黃酮對(duì)NAFLD細(xì)胞模型病理及血脂的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥物與細(xì)胞系 山楂葉總黃酮(HLF)(長(zhǎng)春三九生物制藥，批號(hào):20140823)；水飛薊素膠囊(商品名:利加隆，批號(hào):20140112，德國(guó)馬博士大藥廠生產(chǎn))。人正常肝細(xì)胞L-02株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 化學(xué)藥品與試劑 胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司;油酸(OA)購(gòu)自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;軟脂酸(PA)、油紅O、二甲基亞砜(DMSO)、SDS-PAGE試劑、RNA酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)和小牛血清(FCS)購(gòu)于Gibco公司;甘油三酯(TG)試劑盒、超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶測(cè)試盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程公司;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)購(gòu)于羅氏公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Powerwave X340，美國(guó)Bio-Tek公司；圖像獲取系統(tǒng)，Olympus DP71；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo；倒置顯微鏡，日本Olympus；超低溫冰箱，MDF-382ECM；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝L-02細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃、含5%CO2的溫箱中培養(yǎng)72h,細(xì)胞70%～80% 融合時(shí),以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化傳代,更換培養(yǎng)液。

1.4.2 建立NAFLD細(xì)胞模型 上述培養(yǎng)細(xì)胞換液時(shí)，換成含有1mmol/L 游離脂肪酸(FFA)混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液,誘導(dǎo)24h、48h、72h,收集細(xì)胞,分別進(jìn)行油紅O染色、顯微鏡觀察、計(jì)算細(xì)胞活力和TG測(cè)定等，細(xì)胞模型。

1.4.3 NAFLD細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、水飛薊素組和山楂葉總黃酮(HLF)組共4組，每組分4個(gè)培養(yǎng)瓶，正常組用MEM培養(yǎng)液換液,而模型組、水飛薊組和HLF組換液時(shí)換成含有1mmol/L FFA混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)，其中水飛薊素組加入150μg/ml的水飛薊干預(yù)，HLF組加入400μg/ml的HLF干預(yù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4.4 MTT檢測(cè)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(1×105個(gè)/孔)種植于96孔培養(yǎng)板24h孵育后，各治療組藥物作用L-02細(xì)胞共48h，取出培養(yǎng)板，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入100 μl DMSO，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm條件下測(cè)每孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4.5 電鏡檢測(cè) 各治療組藥物作用L-02細(xì)胞共48h，收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，加2.5%戊二醛固定24h，送浙江大學(xué)測(cè)試中心電鏡室進(jìn)行透射電鏡標(biāo)本的制備及觀察。

1.4.6 觀察指標(biāo)檢測(cè) 觀察根據(jù)試劑盒提供方法檢測(cè)甘油三酯(TG)、Na+-K+-ATP酶及超微量Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力。

2 結(jié)果

2.1 HLF對(duì)NAFLD細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 NAFLD細(xì)胞培養(yǎng)48 h測(cè)各組OD值，各組間比較，模型組內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最高，與HLF組比較有極顯著性差異(P<0.01)，提示模型組內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，藥物干預(yù)后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制狀況能有不同程度緩解。見表1。

表1 HLF對(duì)NAFLD細(xì)胞抑制率的影響

2.2 電鏡檢測(cè)結(jié)果 正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞線粒體豐富，形態(tài)正常，膜與嵴連續(xù)完整，嵴排列整齊，基粒完整；未見明顯異常病變。模型組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體體積增大，明顯水腫，嵴斷裂，甚至消失，基粒脫落，基質(zhì)內(nèi)可見多個(gè)亮區(qū)，外膜有破裂現(xiàn)象，線粒體混濁腫脹明顯；細(xì)胞核的形狀不規(guī)則，呈鋸齒形，出現(xiàn)核固縮碎裂現(xiàn)象，細(xì)胞呈凋亡特征性改變。HLF組肝細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器可見，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，核周間隙清晰，部分線粒體腫脹，線粒體嵴可見，排列紊亂，膜完整，可見線粒體增生分裂現(xiàn)象。水飛薊素組內(nèi)肝細(xì)胞可見各細(xì)胞器，細(xì)胞核異染色質(zhì)增多，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴紊亂、消失，基粒脫落，可見亮區(qū)；線粒體可見膜邊緣模糊，部分膜破裂，線粒體受損。見插頁(yè)彩圖1。

2.3 各組細(xì)胞TG含量的變化 在6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)，各組細(xì)胞TG含量的比較，均有極顯著性差異(見表2)。

表2 各組細(xì)胞TG結(jié)果比較

2.4 各組細(xì)胞超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化 在6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性各組間比較，均有極顯著性差異(見表3、表4)。

表3 各組細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性結(jié)果比較

表4 各組細(xì)胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性結(jié)果比較

3 討論

NAFLD是由于肝臟內(nèi)堆積的脂肪過多，造成肝臟脂肪變性。NAFLD患者通常伴有肝細(xì)胞損傷和肝臟炎癥，稱為NASH。NAFLD和NASH已成為西方國(guó)家頭號(hào)肝病，其發(fā)病率在20年內(nèi)增加了1倍。當(dāng)疾病進(jìn)展為NASH時(shí)患肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，且NASH引起的肝硬化和因肝病死亡的發(fā)生率在近10年分別在20%和12%以上，因此，研究NAFLD的機(jī)制及防治藥物，阻止或延緩其發(fā)生發(fā)展意義重大[5,6]。因NAFLD/NASH的確切病因尚未取得統(tǒng)一意見，目前西醫(yī)對(duì)于NAFLD/NASH缺乏有效的治療方法，而中醫(yī)藥根據(jù)脂肪肝以濕熱內(nèi)蘊(yùn)、脾虛濕痰、痰瘀互結(jié)為基本證型的特點(diǎn)，采用祛濕化痰，活血等治法能明顯改善脂肪肝的臨床癥狀及肝功能、血脂、血糖等多項(xiàng)指標(biāo)，改善肝臟微循環(huán)，促進(jìn)受損肝細(xì)胞的恢復(fù)。中醫(yī)藥在治療過程中無(wú)明顯不良反應(yīng)，因而成為治療脂肪病肝性的特色和優(yōu)勢(shì)[7、8]。

山楂葉為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥葉，有活血化瘀、化濁降脂等功能，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山楂葉總黃酮(HLF)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化應(yīng)激、抗血小板凝聚、抗細(xì)胞凋亡等作用[9、11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組內(nèi)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，通過HLF干預(yù)后，肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制狀況有不同程度的緩解，與模型組比較有顯著性差異?？梢?，肝細(xì)胞在脂肪酸的持續(xù)刺激作用下生長(zhǎng)受到抑制，山楂葉總黃酮能有效緩解NAFLD所致的肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，隨著濃度增加，緩解生長(zhǎng)抑制的效果明顯。模型組中TG在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均持續(xù)升高，在HLF的作用下，TG明顯下降，與模型組比較有極顯著性差異。超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶屬于ATP 酶系統(tǒng)，ATPase是一類與細(xì)胞功能密切相關(guān)的化學(xué)酶，在能量的轉(zhuǎn)換，離子的運(yùn)輸及信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮著巨大的作用[12]。Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP存在于細(xì)胞膜上， 有離子載體的作用，能起到調(diào)節(jié)細(xì)胞膜兩側(cè)的電位平衡、組織滲透壓，為細(xì)胞各種功能活動(dòng)提供能量，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HLF組中Na+-K+-ATP在48h時(shí)間點(diǎn)上活性最高，與模型組及水飛薊素組比較有極顯著性差異(P<0.01)，HLF組中Ca2+-Mg2+-ATP在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的活性，與模型組比較均有極顯著性差異(P<0.01)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，HLF能降低NAFLD對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，降低TG，提高Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP的活性。

線粒體是肝細(xì)胞最重要的細(xì)胞器之一，提供了細(xì)胞所需的90%以上能量。肝細(xì)胞的脂肪變與線粒體氧化功能的改變密切相關(guān)，線粒體的脂肪酸β氧化受損在肝臟脂肪變的過程中起主要作用，凡是干擾了線粒體功能和脂肪酸代謝的因素，都將導(dǎo)致肝臟脂肪變[13～15]。從超微病理圖片分析，模型組肝細(xì)胞內(nèi)線粒體體積增大混濁腫脹明顯，嵴斷裂，甚至消失，基粒脫落，基質(zhì)內(nèi)可見多個(gè)亮區(qū)，外膜有破裂現(xiàn)象，細(xì)胞核鋸齒形改變，有核固縮現(xiàn)象；藥物治療組肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器可見，線粒體部分腫脹，線粒體嵴可見，膜完整，與模型組比較，線粒體形態(tài)變化明顯得到改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楂葉總黃酮對(duì)肝細(xì)胞的能量發(fā)生器—線粒體能起到保護(hù)作用。我們推測(cè)山楂葉總黃酮保護(hù)肝細(xì)胞線粒體的這一特點(diǎn)可能是通過其降脂、抗凋亡、提高細(xì)胞關(guān)鍵酶的活性等綜合作用而達(dá)到的。山楂葉總黃酮能有效改善肝細(xì)胞細(xì)胞器的形態(tài)，降低血脂，維護(hù)肝細(xì)胞的功能，進(jìn)而干預(yù)脂肪肝的發(fā)展進(jìn)程。