不同真菌發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量及酶活性的影響

劉紀(jì)成， 劉 佳， 張 敏， 劉錦妮*， 趙云煥， 吳海港， 姬萬民

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南省大別山區(qū)生態(tài)畜禽健康生產(chǎn)工程研究中心，河南信陽 464000；2.瑞普（天津）生物科技股份有限公司，天津空港經(jīng)濟(jì)區(qū) 300308）

花生是重要五大油料作物之一，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一（王俊宏等，2010）。河南省是全國第一花生生產(chǎn)大省，種植面積1500多萬畝，總產(chǎn)量450多萬噸，花生秸稈產(chǎn)量300～400萬噸，產(chǎn)量豐富（聶勝委等，2015）?；ㄉ斩捹|(zhì)地松軟且營養(yǎng)物質(zhì)豐富，其粗蛋白質(zhì)含量約6%～20%、粗脂肪約2%～3%、碳水化合物（主要是粗纖維）約46% ～48%（劉紀(jì)成等，2017）。但在生產(chǎn)中，花生秸稈在動物飼料中應(yīng)用有限，大部分被直接焚燒或腐解還田，不僅浪費(fèi)了資源，還嚴(yán)重污染環(huán)境。究其主要原因是由于花生秸稈中含有大量的纖維素，畜禽對其消化利用率低，從而影響畜禽生產(chǎn)性能（高靖等，2014）。因此，提高花生秸稈的消化率是未來花生秸稈資源飼料化的關(guān)鍵之一。

農(nóng)作物秸稈的加工處理方法主要有物理機(jī)械法、化學(xué)處理法及生物處理法。有研究表明，秸稈中添加合適的微生物后，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，可提高畜禽對秸稈的適口性及消化率，減少飼料成本及環(huán)境污染 （毛建紅等，2017）。目前，利用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈等為能量生產(chǎn)蛋白飼料的報道較多，而花生秸稈的報道較少。本試驗選擇不同微生物對花生秸稈進(jìn)行發(fā)酵，研究發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量及酶活性的影響，探討其降解花生秸稈纖維物質(zhì)的能力，旨在為花生秸稈的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及菌種 花生秸稈：從信陽市平橋區(qū)宏潤家庭農(nóng)場中取無霉變干花生秸稈，用飼料粉碎機(jī)加工成粉末狀。

菌種：本試驗所使用的綠色木霉（109個/g）、黑曲霉（109個/g）、黃孢原毛平革菌（109個/g）、米曲霉（109個/g）、產(chǎn)朊假絲酵母（1010個/g）、里氏木霉（109個/g）由山東長泰生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備 MBJ-80B培養(yǎng)箱（天津賽得利斯科技有限公司）；YXQ-LS-100A壓力蒸汽滅菌器（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；K1100全自動凱氏定氮儀 （濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；UV-1810紫外分光光度計（北京普析科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生秸稈前處理 將制備好的發(fā)酵飼料裝入500 mL罐頭瓶中，每個瓶內(nèi)均裝花生秸稈100 g，然后加入蒸餾水，使水分含量達(dá)到65%，用牛皮紙包好，放入高壓鍋中121℃高壓滅菌30 min后取出，于潔凈工作臺上放置至室溫，備用。

1.3.2 試驗設(shè)計 試驗分為7組，即試驗1～6組和對照組，對照組花生秸稈不加真菌，6個試驗組花生秸稈分別接種綠色木霉、黑曲霉、黃孢原毛平革菌、米曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、里氏木霉，接種量為5%，每組設(shè)12個重復(fù)，30℃恒溫對花生秸稈進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

1.3.3 樣品的采集 分別在培養(yǎng)5、10、15 d時取樣，每次取三個罐頭瓶，取出的樣品放入恒溫培養(yǎng)箱中40℃烘干備用。

1.3.4 營養(yǎng)成分的測定 微生物發(fā)酵秸稈的粗蛋白質(zhì)（CP）、粗纖維（CF）、粗灰分（CA）測定根據(jù)GB/T6435-86、GB/T6432-86、GB/T6434-86 標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行。微生物發(fā)酵秸稈的中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維 （ADF）測定根據(jù)GB/T6438-86、GB/T6438-86標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.5 酶活性測定 纖維素酶（CMC）活性、淀粉酶活性均采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸）法測定。

1.3.6 還原糖測定 還原糖含量測定采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法，在 5～50 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖線性方程為 y=0.014x+0.099（n=6，r=0.9975）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007整理后，采用SAS 8.0軟件GLM程序進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著的評判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量的影響由表1可知，不同真菌發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量均有一定的影響，隨著發(fā)酵時間的延長，花生秸稈中 CP 含量呈現(xiàn)增加趨勢，CF、CA、NDF、ADF 呈現(xiàn)下降趨勢，但是發(fā)酵10 d和15 d后各營養(yǎng)成分之間差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，發(fā)酵5 d后，黑曲霉、黃孢原毛平革菌、產(chǎn)朊假絲酵母、里氏木霉組花生秸稈的CP含量分別提高了23.90%、15.89%、12.80%、13.95%，而米曲霉、綠色木霉組花生秸稈的CP含量和對照組相比變化不顯著（P＞0.05）。各組花生秸稈的CF含量較對照組分別降低了 22.56%、16.85%、25.40%、14.79%和13.58%。但米曲霉變化不顯著（P＞0.05）。CA、NDF、ADF的含量較對照組有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。和發(fā)酵5 d相比，發(fā)酵10 d后各組花生秸稈的CP含量較對照組均有所提高，分別提高了 6.28%、12.41%、7.13%、3.84%、26.95%和14.04%，CF含量分別降低 12.25%、5.18%、11.17%、3.68%、8.89%和 15.305%；和對照組相比，發(fā)酵10 d后各組花生秸稈的CP含量分別提高了 4.34%、37.68%、22.73%、3.70%、51.60%和28.61%，CF含量分別降低 28.42%、18.19%、31.13%、5.35%、19.45%和24.05%，各組花生秸稈的NDF、ADF含量均有有所下降，其中黃孢原毛平革菌發(fā)酵后NDF、ADF含量最低，較對照組分別降低了11.10%、15.56%。在發(fā)酵15 d和發(fā)酵10 d相比各營養(yǎng)含量差異不顯著（P＞0.05）。因此，從花生秸稈成分降解情況綜合考慮，發(fā)酵10 d后的效果較好。

2.2 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈酶活性的影響由表2可知，不同真菌發(fā)酵對花生秸稈纖維素酶、淀粉酶的活性存在差異，隨著發(fā)酵時間的延長，纖維素酶、淀粉酶的活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。綠色木霉、里氏木霉發(fā)酵花生秸稈5 d后纖維素酶活性比發(fā)酵10、15 d的活性高，發(fā)酵15 d后纖維素酶活性和對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。黑曲霉、黃孢原毛平革菌、產(chǎn)朊假絲酵母在發(fā)酵10 d后纖維素酶活性最高，和對照組相比差異顯著（P＜0.05）。各組淀粉酶活性在發(fā)酵10 d后活性最高，其中產(chǎn)朊假絲酵母組淀粉酶活性最強(qiáng)，活性是對照組的6倍以上（P＜0.05），而試驗各組中淀粉酶活性在發(fā)酵15 d后顯著降低。

表1 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量的影響%

3 討論

3.1 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈營養(yǎng)含量的影響飼料中粗蛋白質(zhì)、粗纖維及粗灰分是衡量飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)（周明，2014）。研究表明，利用微生物對農(nóng)作物秸稈進(jìn)行處理后可以提高飼料中常規(guī)營養(yǎng)成分的含量，改變飼料的營養(yǎng)價值，提高飼料利用率 （陳帥，2017；韓雅慧，2016）。王雷雷等（2015）采用六種真菌對花生秸稈進(jìn)行發(fā)酵處理后，花生秸稈粗蛋白質(zhì)含量提高30%，粗脂肪提高1.4%，粗灰分含量降低50%，且試驗結(jié)果表明不同真菌發(fā)酵后，花生秸稈的營養(yǎng)價值存在一定差異。李術(shù)娜等（2015）采用復(fù)合菌劑發(fā)酵花生秧粉后其粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維分別下降25.57%、11.35%、9.50%；粗蛋白質(zhì)、有機(jī)酸與總能分別增加52.23%、66.34%、52.98%。宋洛文等（2001）試驗結(jié)果表明，微生物發(fā)酵飼料的感官新鮮，氣味酸甜，適口性好，可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量，同時可以節(jié)省精料用量17.90%。本研究也證實真菌發(fā)酵對飼料品質(zhì)有改善作用，采用黑曲霉、黃孢原毛平革菌、產(chǎn)朊假絲酵母、里氏木霉發(fā)酵花生秸稈后，花生秸稈中CP含量分別提高了23.90%、15.89%、12.80%、13.95%，CF含量分別降低了16.85%、25.40%、14.79%和13.58%。這與上述文獻(xiàn)報道的存在一定差異，這可能與所選用的真菌不同有關(guān)，提示生產(chǎn)實踐中可根據(jù)需要選擇合適的發(fā)酵菌種。此外本試驗發(fā)現(xiàn)花生秸稈在發(fā)酵10 d后的各營養(yǎng)成分變化最為明顯，提示生產(chǎn)實踐中花生秸稈發(fā)酵時間10 d為宜。

表2 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈酶活性的影響U/g

表3 不同真菌發(fā)酵后花生秸稈的還原糖含量mg/g

3.2 不同真菌發(fā)酵對花生秸稈酶活性及還原糖含量的影響 纖維素是農(nóng)作物秸稈中的主要成分，也是影響動物機(jī)體對蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用重要因素之一（郭紅偉，2013）。纖維素酶是常見廣泛存在的一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等構(gòu)成，其在一定的條件下可以將不易被利用的植物纖維素水解成較小分子的纖維二糖和葡萄糖等糖類，從而提高動物對高纖維飼料的消化吸收率。淀粉酶主要促進(jìn)飼料中淀粉成分的降解，提高動物機(jī)體對營養(yǎng)成分吸收利用（賈佳，2009）。研究表明，許多微生物可產(chǎn)生纖維素酶和淀粉酶，且真菌所產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶產(chǎn)量高，活性大，能夠提高畜禽對植物飼料的利用率（曾輝，2017；顧擁建，2017； 巴桑珠扎，2017； 葉川，2011）。 Huzairy 等（2014）采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵稻秸，發(fā)酵后淀粉酶活力達(dá)到276 U/g。潘立博等（2012）使用白腐菌與酵母菌混合發(fā)酵稻草秸稈，其纖維素酶的活性呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，且在發(fā)酵第6天后纖維素酶活性最強(qiáng)。任勰珂等（2017）報道綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母三種菌種對玉米秸稈發(fā)酵作用最為明顯，發(fā)酵3 d后，酵纖維素酶活達(dá)到85.73 U/mL。辛總秀等（2008）研究發(fā)現(xiàn)采用纖維素酶可以提高玉米秸稈中還原糖的含量，其含量由11.13%增加到28.66%。魏如騰（2016）采用芽孢桿菌、黑曲霉和里氏木霉三株菌發(fā)生玉米秸稈，其發(fā)酵36 h后，纖維素酶活性達(dá)到404.28 U/mL。而王雷雷（2015）采用六種真菌發(fā)酵對花生秸稈，其中三種真菌產(chǎn)生的酶較少，活力均較弱。而本試驗中綠色木霉和里氏木霉發(fā)酵5 d后纖維素酶活性最強(qiáng)，其活性為220.22 U/L和207.16 U/L，而黑曲霉、黃孢原毛平革菌、產(chǎn)朊假絲酵母在發(fā)酵10 d后纖維素酶活性最高，且產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)生淀粉酶活性最強(qiáng)，這與上述文獻(xiàn)報道存在一定差異，這可能與本試驗中所選擇的溫度、底物濃度、氮源、水分以及物理因素等多種因素有關(guān)。此外本試驗還發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長纖維素酶、淀粉酶活性及還原糖含量呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，隨著發(fā)酵時間的延長酶活性逐漸降低，這可能是由于采用真菌發(fā)酵秸稈時間過長，發(fā)酵菌種已經(jīng)生長到旺盛期后期，引起產(chǎn)酶性能降低，所產(chǎn)的酶出現(xiàn)了部分失活的現(xiàn)象。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，在花生秸稈中添加真菌可以提高花生秸稈中的營養(yǎng)成分，提高產(chǎn)物中纖維素酶、淀粉酶活力及還原糖含量，提高畜禽機(jī)體對花生秸稈中各營養(yǎng)成分吸收利用，提高花生秸稈的利用率，且發(fā)酵10 d效果比較理想。