查樹偉 查佶 傅雅麗 鄒文霓 許豪勤

耳聾基因篩查研究主要集中在耳聾患者、正常孕期人群、新生兒以及孕(婚)前耳聾基因篩查人群，篩查方法多采用耳聾基因芯片檢測常見遺傳性耳聾的4個基因9個位點。目前臨床耳聾基因篩查和診斷研究還涉及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、全外顯子組測序、多重置換擴增和單核苷酸多態(tài)分型等技術(shù)。本文簡要闡述有關(guān)耳聾基因檢測技術(shù)應(yīng)用和研究現(xiàn)狀。

一、6個通過國家食品藥品監(jiān)督局(SFDA)批準的耳聾基因篩查試劑盒檢測特點

目前耳聾基因篩查檢測方法主要是2009年—2014年6個通過SFDA批準的耳聾基因篩查試劑盒[1]，孕前耳聾基因篩查研究采用9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，檢測4個常見耳聾基因中的9個位點，包括GJB2基因c.35 del G、c.176 del 16、c.235 del C、c.299 del AT，GJB3基因c.538 C>T，SLC26A4基因c.2168 A>G、IVS7-2 A>G和線粒體12S rRNA基因1494 C>T、1555 A>G。6個試劑盒檢測特點見表1。

二、耳聾基因篩查(檢測)獲得專利的檢測方法

2014年—2016年(萬方數(shù)據(jù)-專利：“耳聾基因”，檢索日期2017年2月12日)[2]中國已有16個申請獲得的耳聾基因篩查(檢測)專利(見表2)。在這些專利中，中南大學湘雅醫(yī)院(馮永等)的專利“耳聾基因篩查芯片”具有高通量和覆蓋面廣的優(yōu)勢：芯片共包含384個檢測位點，涵蓋了線粒體及46個位于常染色體上的不同耳聾基因，包含240個耳聾突變位點和144個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，其中耳聾突變位點中包括200個非綜合癥耳聾位點和40個常見綜合征耳聾位點。濟南英盛生物技術(shù)有限公司(馮振等)分別申請并獲得3項有專門針對性基因的檢測專利：①“一種先天性耳聾基因多通道熒光PCR檢測試劑盒”，首次實現(xiàn)了應(yīng)用多通道熒光PCR方法在同一個反應(yīng)管中同時檢測先天性耳聾的8個突變位點，包括GJB2基因的6個位點和GJB3基因的2個位點；②“一種藥物性耳聾基因多通道熒光PCR檢測試劑盒”，同時檢測藥物性耳聾的4個突變位點，即mtDNA 12S rRNA基因的4個位點，以有效預(yù)防藥物性耳聾發(fā)生；③“一種遲發(fā)性耳聾基因多通道熒光PCR檢測試劑盒”，同時檢測遲發(fā)性耳聾的7個突變位點，即SLC26A4基因的7個位點，以有效預(yù)防遲發(fā)性耳聾發(fā)生。

表1 6個通過SFDA批準的耳聾基因篩查試劑盒檢測特點

表2 2014年—2016年申請獲得的耳聾基因篩查(檢測)專利

三、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)：

MALDI-TOF-MS技術(shù)是在化學、生物、醫(yī)療衛(wèi)生等眾多領(lǐng)域得到廣泛研究應(yīng)用的一種新型“軟電離”質(zhì)譜技術(shù)，它可以對樣品進行定性或定量分析,從質(zhì)譜圖上可獲得樣品中每一分子的分子量，以及通過譜峰強度計算樣品的平均分子量與分子量分布寬度[3]。用針對耳聾基因的20個位點，較9項試劑盒增加11個位點，即GJB2：176-191del16，GJB3：547G>A，SLC26A4：281C>T、589G>A、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T。因此具有檢測位點多、覆蓋率高、準確、高通量、低成本和周期短等特點，能夠滿足臨床對耳聾基因檢測的要求，適合大范圍、大規(guī)模的檢測項目[4]，并已在許多新生兒耳聾基因篩查大規(guī)模檢測項目中應(yīng)用和研究。

四、測序技術(shù)發(fā)展與耳聾基因診斷研究

DNA測序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學和生物醫(yī)學研究中常用的一種技術(shù)手段。1954年Whitfeld等報道用化學降解進行多聚核糖核苷酸測序方法，1977年第一代測序技術(shù)(Sanger測序法)出現(xiàn)，由于高昂的測序成本限制了第一代測序技術(shù)更常規(guī)的使用，2005年以后出現(xiàn)的新(下)一代測序技術(shù)(nextgeneration sequencing technology，NGS)，又稱第二代測序技術(shù)，或高通量測序(high-throughput sequencing)，或深度測序(deep sequencing)技術(shù)，由于測序成本的大幅度降低，使之成為解決一般性的基因分子生物學問題的有效工具。高通量測序技術(shù)能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，就耳聾基因研究和基因診斷而言，基于靶向捕獲和高通量測序，可針對絕大多數(shù)已知耳聾基因進行一次性全序列突變檢測。第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)，DNA測序時，不需要經(jīng)過PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序。雖然測序技術(shù)越來越成熟，成本也越來越低，但在遺傳性耳聾方面一個很大的挑戰(zhàn)是如何認識基因變異對耳聾發(fā)生和發(fā)展的影響。隨著測序技術(shù)日趨成熟，測序研究提示更多可能導(dǎo)致遺傳性耳聾發(fā)生的基因，同時通過相應(yīng)的功能研究來證實，遺傳性耳聾的本質(zhì)會逐漸被揭示出來[5]。

五、全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)技術(shù)

WES是一種只針對外顯子區(qū)域DNA的新型基因組分析技術(shù)。該技術(shù)首先將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集，再進行高通量測序，然后結(jié)合生物信息學分析鑒定罕見及常見疾病相關(guān)的致病基因。有專家學者分別闡述了目標序列捕獲及平行測序在臨床耳聾基因診斷中的應(yīng)用，全外顯子組測序技術(shù)及其在遺傳性耳聾研究中的應(yīng)用，運用全外顯子組測序技術(shù)診斷非綜合征性耳聾基因變異等[6-8]，表明這一技術(shù)具有耳聾基因診斷的應(yīng)用前景。

六、多重置換擴增(multiple displacement amplification，MDA)技術(shù)

MDA技術(shù)是全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)技術(shù)的一種，能夠提供高度均一完整的全基因組序列，使產(chǎn)物與模板的遺傳序列信息保持一致，是一種真正意義的全基因組擴增方法[9]。MDA技術(shù)是1998年Lizardi等[10]基于環(huán)狀滾動擴增方法創(chuàng)建的一種鏈置換擴增技術(shù)，利用phi29 DNA聚合酶和六聚體隨機引物對基因組進行擴增，不需要經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)熱循環(huán)過程，只需在30℃條件下恒溫即可反應(yīng)。擴增時，phi29 DNA聚合酶在多個位點同時起始復(fù)制，合成新的DNA鏈取代模板互補鏈，被置換出新的DNA鏈又成為模板來進行擴增，形成級聯(lián)分支的放大系統(tǒng)。最終生成大量的高保真基因組DNA，為單細胞多次分析提供了可能[11]?！耙环N用于在單細胞水平上同時檢測多種耳聾基因的試劑盒”專利就是通過MDA技術(shù)，從單細胞樣本等DNA含量極其微少的樣本中有效擴增得到總量在μg級的全基因組DNA。

七、單核苷酸多態(tài)分型(single nucleotide polymorphisms scan，SNPscan)技術(shù)

SNPscan技術(shù)是一個快速多基因檢測系統(tǒng)，能在一個檢測流程中同時實現(xiàn)對48/96/144/192個位點進行分型。SNPscan技術(shù)基本原理是利用連接酶連接反應(yīng)的高特異性實現(xiàn)對SNP位點等位基因的識別，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應(yīng)獲得位點對應(yīng)的不同長度連接產(chǎn)物，利用熒光標記的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，最后通過對電泳圖譜的分析獲取各個SNP位點的基因型。SNPscan是一項高通量和低成本的檢測技術(shù)，在對225例非綜合征型耳聾患者(即225個樣本3個基因115個位點)的SNPscan基因檢測中，初篩中找到有明確致聾基因的患者111例(49.3%)，接近60%的理想目標，另外耳聾基因攜帶者30例(13.3%)，篩查結(jié)果均為陰性者84例(37.3%)。SNPscan檢測結(jié)果經(jīng)抽樣Sanger測序驗證，符合率達100%。應(yīng)該指出，到目前為止直接測序法仍然是基因突變檢測的金標準，其在結(jié)果驗證和新基因突變位點的檢測等領(lǐng)域還是不可替代的，但直接測序?qū)τ诖笠?guī)?；蚝Y查來說太過昂貴和耗時。因此有必要研究和探索適宜于耳聾基因篩查和檢測的新技術(shù)和好方法[12]。

八、胚胎植入前遺傳學診斷技術(shù)(PGD)

Handyside等[13]于1990年報道運用胚胎移植前遺傳學診斷技術(shù)(PGD)成功妊娠，使得PGD開始應(yīng)用于臨床。PGD是采用輔助生殖方法，通過遺傳診斷技術(shù)，挑選健康的胚胎進行子宮移植，獲得表型正常的后代。PGD已廣泛應(yīng)用于單基因遺傳性疾病和染色體異常性疾病以及線粒體疾病，遺傳性耳聾絕大部分為單基因變異，是PGD適應(yīng)癥[14]。Altarescu等[15]于2009年報道利用極體和卵裂球活檢對非綜合征性遺傳性耳聾患者采用PGD獲得成功妊娠。2010年國立臺灣大學醫(yī)學院多?？坡?lián)合對已生育一名因SLC26A4耳聾基因突變導(dǎo)致大前庭水管綜合征(EVAS)患兒的夫婦進行了PGD輔助生殖干預(yù)，成功妊娠并生育基因為野生型的單胎嬰兒，出生后聽力篩查正常[16]。2015年中國大陸首例先天性耳聾胚胎植入前遺傳學診斷健康試管嬰兒誕生[17]。

另外，還有學者對Wolfram綜合征的致病基因wolframin基因(WFS1)[18-20]，與X連鎖隱性遺傳綜合征型耳聾相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白2(GPRASP2)基因[21]，線粒體導(dǎo)致非綜合征型耳聾兩個突變熱點區(qū)域之一的線粒體tRNASer(UCN)基因[22，23]進行了檢測技術(shù)研究。