梁建慶，何建成

左旋多巴誘發(fā)異動癥(levodopa-induced dykinesias，LID)是帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者常見的藥物并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)左旋多巴(levodopa)治療4～6年后，約40%的PD患者會出現(xiàn)LID[1]，可不同程度地影響PD患者的日常生活，嚴重時具有致殘性。本課題組前期動物實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)，復方地黃顆粒治療PD有效[2]?；诖?，本研究擬建立LID大鼠模型，探討復方地黃顆粒對其神經(jīng)行為學的影響，為中藥新藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及條件 SPF級雄性SD大鼠，體重180～200g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[許可證號：SYXK(滬)2012-0002]。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫(23±2)℃，自動光-暗控制(7:00～19:00光照，19:00～7:00暗置)，相對濕度60%～65%，自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器 6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA，批號：MKBP0832V)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO，批號：SLBF6369V)、抗壞血酸(批號：063K1082)、左旋多巴干粉(批號：192K1885)、芐絲肼(批號：B22851)為美國Sigma公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉(批號：WS20130112)為上海中西藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；慶大霉素(批號：20130675)為上海第一制藥廠產(chǎn)品，0.3g/支。RWD-68003型大鼠腦立體定位儀為深圳瑞沃德生命科技有限公司產(chǎn)品。

委托國家中藥制藥工程技術(shù)研究中心制備復方地黃顆粒。處方：熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母、丹參、石菖蒲、全蝎，共45.6kg(上海中醫(yī)藥大學提供)。制法：以上七味藥物浸液過濾后減壓濃縮成相對密度1.30(60℃)的清膏，減壓干燥，粉碎；以淀粉與糊精的等比混合物為輔料，浸膏粉與輔料比為2:1，一步制粒。大鼠中藥的每日用量，按孫瑞元教授建立的標準體重大鼠每日用量方法計算[3]。

1.3 陰虛動風證PD大鼠LID模型的制備、分組與給藥 陰虛動風證PD模型以6-OHDA誘導，采用Ungerstedt[4]建立并經(jīng)本課題組反復驗證的二點法進行構(gòu)建[5-6]。造模前常規(guī)測試神經(jīng)行為學表現(xiàn)，確認大鼠無異常旋轉(zhuǎn)行為；造模10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)后30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均＞7次/min者為合格的PD模型[7]。PD模型大鼠給予腹腔注射左旋多巴/芐絲肼(50mg/kg左旋多巴和12.5mg/kg芐絲肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水中)，每日2次，連續(xù)2周；異常不自主動作(abnormal involuntary movement，AIM)評分20，且APO誘導大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加者，為成功的陰虛動風證LID模型[8](圖1)。

圖1 帕金森病LID動物模型制備Fig.1 Levodopa-induced dyskinesia of Parkinson's disease model rats

采用區(qū)層隨機法，將造模成功的LID模型大鼠隨機分為模型組(Model組)和復方地黃顆粒組(CRG組)，每組10只；根據(jù)課題組前期預實驗結(jié)果，復方地黃顆粒組給予中藥復方地黃顆粒(14g/kg，2ml)灌胃，模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)用藥6周。另設(shè)正常組(NC組)和假手術(shù)組(SO組)，每組10只；正常組除捆綁外不作其他處理，假手術(shù)組構(gòu)建PD模型時腦內(nèi)注射0.2%抗壞血酸水溶液，繼而腹腔注射含0.05%乙醇和0.1%抗壞血酸的注射用水，2周后給予生理鹽水2ml灌胃。實驗動物于給藥4周、6周兩個時間點進行神經(jīng)行為學評定。

1.4 陰虛動風證LID大鼠神經(jīng)行為學觀察 LID大鼠模型的行為學觀察內(nèi)容主要包括AIM評分及對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為的評定，并進行APO誘導LID大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為的評定。

1.4.1 LID大鼠行為學觀察與AIM評分 于復方地黃顆粒給藥第4、6周對大鼠進行AIM評分。用藥后每間隔35min評定1次，連續(xù)評定4組數(shù)據(jù)，持續(xù)140min，4次評分之和為最終得分[9]。主要行為學定義及賦分如下：

(1)肢體運動障礙：損毀對側(cè)前肢重復、節(jié)律性的反射運動或肌肉運動障礙。

0分：無；1分：逐漸出現(xiàn)的可辨別的對側(cè)前肢反射運動；2分：間歇性高頻率的對側(cè)前肢運動；3分：持續(xù)性高頻率的肌肉運動，刺激可使之停止；4分：持續(xù)性高頻率的肌肉運動，刺激無法使之停止。

(2)軸性運動：頭部及軀體朝向損毀側(cè)的側(cè)屈及軸性旋轉(zhuǎn)。

0分：無；1分：以兩足站立時軀體經(jīng)常性向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；2分：以兩足站立時軀體經(jīng)常性向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)同時伴有間歇性頭頸側(cè)屈；3分：持續(xù)頭頸及軀干對側(cè)旋轉(zhuǎn)，但仍可保持平衡；4分：頭頸及軀干強迫性抽搐，無法保持平衡。

(3)咀嚼行為：重復性的吐舌及下顎咀嚼行為。

0分：無；1分：偶然出現(xiàn)咀嚼運動；2分：頻繁出現(xiàn)咀嚼運動；3分：持續(xù)性出現(xiàn)小幅度咀嚼運動；4分：強迫性大幅度重復咬噬動作并伴有頻繁的吐舌行為。

(4)對側(cè)旋轉(zhuǎn)：向損毀對側(cè)轉(zhuǎn)身或旋轉(zhuǎn)。

0分：無；1分：固定偏向一側(cè)的轉(zhuǎn)身，運動行為有可能增強；2分：間歇性穩(wěn)定的對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：持續(xù)性地對側(cè)旋轉(zhuǎn)，刺激可使之停止；4分：持續(xù)性的對側(cè)旋轉(zhuǎn)，刺激無法使之停止。

1.4.2 LID大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為的評定 大鼠于復方地黃顆粒給藥第4周、6周進行對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為學觀察，記錄旋轉(zhuǎn)起動時間(以s為單位，記錄PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴/芐絲肼后開始向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的時間)、旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間(以min為單位，記錄PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴/芐絲肼后向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的持續(xù)時間)、30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(采用秒表記錄，計算大鼠30min內(nèi)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù))、5min劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(采用秒表記錄，計算大鼠5min內(nèi)向左側(cè)開始旋轉(zhuǎn)的圈數(shù))的動態(tài)變化。

1.4.3 APO誘導大鼠對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為的評定 在LID模型制備成功后，復方地黃顆粒灌胃用藥4、6周時腹腔注射APO 0.5mg/kg以誘發(fā)大鼠向損毀對側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄開始旋轉(zhuǎn)后30min內(nèi)的總旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用表示，在滿足方差齊性條件下，采用獨立樣本t檢驗進行兩樣本間的比較，采用單因素方差分析進行多樣本比較，進一步兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠AIM評分的動態(tài)變化 與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠AIM評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。復方地黃顆粒干預后，大鼠AIM評分顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表1)。

表1 大鼠AIM評分的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.1 Dynamic changes of AIM score of rats (±s,n=10)

表1 大鼠AIM評分的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.1 Dynamic changes of AIM score of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group,(2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with Model group

6 weeks after treatment NC 0 0 0 SO 0 0 0 Model 27.01±4.01(1)(2) 30.02±3.13(1)(2) 33.10±5.27(1)(2)CRG 28.45±3.45(1)(2) 21.63±2.99(1)(2)(3) 24.23±4.99(1)(2)(3)Group Before treatment 4 weeks after treatment

2.2 大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化 與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。復方地黃顆粒干預后，大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表2)。

表2 大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.2 Dynamic changes of rotation start time,rotation duration,rotation number,flux peak rotation number of rats (±s,n=10)

表2 大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.2 Dynamic changes of rotation start time,rotation duration,rotation number,flux peak rotation number of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with M group

Item NC SO Model CRG Rotation start time(s)Before treatment 0 0 217.19±102.68(1)(2) 221.00±110.82(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 114.62±47.96(1)(2) 301.75±108.92(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 191.38±102.15(1)(2) 351.62±59.13(1)(2)(3)Rotation duration time (min)Before treatment 0 0 202.62±16.88(1)(2) 199.06±15.29(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 228.38±34.31(1)(2) 188.75±27.38(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 248.12±32.50(1)(2) 164.50±19.90(1)(2)(3)Rotation number Before treatment 0 0 669.38±211.19(1)(2) 670.56±220.45(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 931.00±254.79(1)(2) 450.12±140.07(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 733.62±241.96(1)(2) 423.38±139.12(1)(2)(3)Flux peak rotation number Before treatment 0 0 119.12±39.57(1)(2) 120.81±50.97(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 171.12±60.11(1)(2) 88.75±39.33(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 156.75±50.71(1)(2) 59.75±29.88(1)(2)(3)

2.3 APO誘導后大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化 與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。復方地黃顆粒干預后，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯縮短，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表3)。

表3 APO誘導后大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.3 Dynamic changes of APO-induced rotation number of rats (±s,n=10)

表3 APO誘導后大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化(±s，n=10)Tab.3 Dynamic changes of APO-induced rotation number of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with M group

Group Before treatment 4 weeks after treatment 6 weeks after treatment NC 0 0 0 SO 0 0 0 Model 501.12±16.38(1)(2) 838.36±35.31(1)(2) 647.12±32.53(1)(2)CRG 499.06±15.39(1)(2) 485.75±27.48(1)(2)(3) 466.50±19.95(1)(2)(3)

3 討 論

LID表現(xiàn)為舞蹈癥或手足徐動樣不自主運動，可累及頭面部、四肢和軀干，有時表現(xiàn)為單調(diào)刻板的不自主動作或肌張力障礙，嚴重影響患者行動[10]。LID的發(fā)生機制尚不清楚，目前尚無根治辦法。李晉梅等[11]篩選符合英國腦庫PD診斷標準并且應(yīng)用左旋多巴制劑至少1個月的患者，根據(jù)LID臨床定義判斷有無LID，分為異動和非異動兩組，比較兩組患者的性別、年齡、發(fā)病年齡、病程、體重、帕金森病綜合評分量表(unified Parkinson's disease rating scale，UPDRS)等臨床參數(shù)，以及左旋多巴最大日劑量、累計用藥時間、單位體重用量等治療參數(shù)方面上有無差異，并用logistic多因素回歸分析LID的獨立危險因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD患者發(fā)生LID的危險因素有多種，其中左旋多巴最大日劑量和單位體重的左旋多巴用量為獨立危險因素。劉宇翔等[12]探討帕金森病LID發(fā)生的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)女性患者年齡及發(fā)病年齡較輕、病程較長、使用左旋多巴日劑量較大者易發(fā)生LID。張旺明等[13]認為，左旋多巴誘導的LID是PD患者常見的、致殘性的服藥晚期并發(fā)癥，一旦癥狀出現(xiàn)，則無法通過藥物治療得到顯著緩解。

近年來大量的研究表明，中醫(yī)藥無論是在PD治療方面，還是在降低左旋多巴的不良反應(yīng)方面都卓有成效。中醫(yī)學認為，LID屬于“顫證”范疇，又稱“震振”、“振掉”、“震顫”，基本病機為肝風內(nèi)動，筋脈失養(yǎng)。復方地黃顆粒由熟地黃、白芍、鉤藤、珍珠母、丹參、石菖蒲、全蝎組成；方中熟地黃性溫味甘，歸肝腎經(jīng)，善補益腎精、滋陰養(yǎng)血、固本培元，故為君藥；鉤藤甘涼，入肝心經(jīng)，功效熄風定驚、化痰舒筋；珍珠母性味咸寒，歸肝心經(jīng)，可滋陰潛陽、定驚止顫、養(yǎng)血舒筋，柔肝與熄風兩者兼顧，滋陰與養(yǎng)血并療，乃平肝潛陽之要藥；白芍性味苦酸微寒，歸肝脾經(jīng)，養(yǎng)肝血、滋肝陰、柔肝氣，為養(yǎng)血濡筋、緩急止顫之良藥，與鉤藤、珍珠母同用，可助君藥滋陰養(yǎng)血、熄風平肝，共為臣藥；丹參味苦，微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，功效養(yǎng)血、活血、化瘀；石菖蒲辛苦溫，歸心胃經(jīng)，功效化痰除濕、開竅醒神，共為佐藥；全蝎辛平有毒，歸肝經(jīng)，集解毒熄風、化痰祛瘀、通絡(luò)散結(jié)于一體，為使藥。上述諸藥合用，可滋補肝腎、活血化痰、散結(jié)解毒[2]。

本研究采用二點法將6-OHDA注射于SD大鼠右側(cè)黑質(zhì)來構(gòu)建PD動物模型，向PD大鼠腹腔注射左旋多巴/芐絲肼，成功構(gòu)建陰虛動風證帕金森病LID模型。本課題組前期研究證實，該模型具有疾病(帕金森病LID)和證候(陰虛動風證)的雙重特征[6]。PD模型大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)行為學的異常變化，如大鼠AIM評分出現(xiàn)異常變化，大鼠旋轉(zhuǎn)起動時間、持續(xù)時間、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)存在動態(tài)變化，APO誘導后大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的動態(tài)變化。這些表現(xiàn)和PD患者的臨床證候高度類似，如震顫、肌強直、運動遲緩、自主神經(jīng)功能障礙等，為研究復方地黃顆粒干預PD提供了動物模型支撐。本研究結(jié)果顯示，復方地黃顆粒干預后，LID大鼠AIM評分顯著降低，旋轉(zhuǎn)起動時間延長，旋轉(zhuǎn)持續(xù)時間縮短，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明復方地黃顆?？筛纳婆两鹕ID模型大鼠的神經(jīng)行為學表現(xiàn)，緩解LID乃至PD癥狀。