侯曉杰，梁魁景，歐陽汝欣，蘆站根

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

近年來蘋果輪紋病的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)生頻率大幅增加，嚴(yán)重影響了我國蘋果品質(zhì)和產(chǎn)量，使果農(nóng)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國華北、華東、東北等地蘋果輪紋病發(fā)生嚴(yán)重，國光、富士、金冠、紅月等都是易感品種[1]。目前，植物內(nèi)生菌在病蟲害生物防治方面已經(jīng)應(yīng)用，植物內(nèi)生真菌、細(xì)菌、放線菌防治植物病害效果顯著。例如，利用大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌防治棉花枯萎病[2]，桃樹根部內(nèi)生細(xì)菌防治桃褐腐病[3]，劍麻內(nèi)生細(xì)菌JM-3防治蘋果腐爛病[4]，姜、蒜內(nèi)生菌防治蘋果輪紋病[5]等。

衡水湖的外來入侵植物黃頂菊Flaveriabidentis，根莖發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，具較強(qiáng)的化感作用。黃頂菊入侵性如此強(qiáng)大，在其體內(nèi)的內(nèi)生菌與它互利共生，所以肯定具有協(xié)同作用[6]。菌株本身或分泌物具有抑制其他植物生長的化學(xué)物質(zhì)。本研究以衡水湖外來入侵植物黃頂菊為材料，研究其組織內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生菌對于蘋果輪紋病病菌Botryosphaeriadothidea是否有拮抗作用[7]，期望找出能夠抑制蘋果輪紋病病菌生長的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料 黃頂菊，2015年10月6日采于衡水湖國家濕地公園，1 a生完整植株。蘋果輪紋病病菌，來源于衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化 用自來水沖洗黃頂菊3 min，去除植株表面附著的泥沙，室內(nèi)晾干。分別取根、莖、葉、花各5 g，無菌水清洗干凈，置于75%酒精溶液中浸泡30 s，轉(zhuǎn)至3.125%次氯酸鈉溶液中浸泡6 min，無菌水清洗5次。將各部分組織分別剪碎放入研缽中，加入10 mL無菌水，充分研磨，靜置備用。分別吸取50，100，150 μL研磨液，涂抹于NA平板上，每組織重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待菌落長出后，觀察記錄菌落形態(tài)、邊緣光滑度、大小、顏色，挑取單菌落劃線純化，4 ℃保存。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌對蘋果輪紋病病菌的對峙培養(yǎng) 注入2 mL無菌水至純化的內(nèi)生菌培養(yǎng)皿內(nèi)，玻璃刮棒輕輕刮取平板上的細(xì)菌，用移液器吸取渾濁液轉(zhuǎn)至三角瓶，密封瓶口后震蕩1min使液體混合均勻。用722分光光度計調(diào)整細(xì)菌懸濁液濃度，使其波長665 nm下的OD值為1.000，密封口備用。用直徑1 cm的打孔器在復(fù)壯后的蘋果輪紋病培養(yǎng)基上打孔，挑取菌餅倒扣接種在新的PDA平板上。以菌餅為中心，周圍均勻放置3個直徑1 cm的圓形滅菌濾紙片，濾紙片中心距培養(yǎng)皿邊緣約1.5 cm，每濾紙片分別接種50 μL細(xì)菌懸濁液，每種細(xì)菌重復(fù)3次。對照為無菌水。PDA平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel軟件處理數(shù)據(jù)及作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為5%(P<0.05)。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 由于分離培養(yǎng)時吸取的100，150 μL研磨液的NA平板上菌落密度過大，無法辨別單個菌落的特征，所以只對50 μL研磨液平板上的菌株進(jìn)行篩選。通過觀察，黃頂菊植株內(nèi)共分離到14株菌株(表1)，其中根、莖、葉組織各分離到4株，花組織分離到2株。根、莖、葉器官的分離比率較高。

表1 黃頂菊組織可培養(yǎng)內(nèi)生菌的分離結(jié)果

2.2 對峙培養(yǎng) 除根3菌株外其余13株菌株都對蘋果輪紋病菌絲有抑制效果。菌株莖1、莖2、莖4、花1、花2抑菌效果與對照比較具有顯著性差異，但這5菌株之間抑制效果差異性不顯著。抑菌效果最好的莖4菌株，其真菌菌落直徑為(39.96±2.66) mm，抑菌率為33.21%(表2)。

表2 黃頂菊組織內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌對蘋果輪紋病病菌的菌絲生長抑制結(jié)果

注:表中同列標(biāo)有不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

黃頂菊植株各組織器官均能分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，且大部分菌株對蘋果輪紋病菌絲生長具有抑制效果，其中莖、花組織內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果較好，抑菌率最高達(dá)33.21%，說明黃頂菊內(nèi)生細(xì)菌是潛在的生防菌資源，可為進(jìn)一步篩選蘋果輪紋病的生防制劑奠定基礎(chǔ)。根3菌株的抑菌率為-1.34%，說明該菌株對蘋果輪紋病菌絲生長不但無效還起到了刺激其生長的作用，后續(xù)實驗有待驗證。

目前，黃頂菊的研究主要集中在生理、生態(tài)、基礎(chǔ)防除及生物活性和化學(xué)成份等方面[8-11]，其生物成份和化學(xué)成份具有抗菌、殺蟲活性[12]。本文對于黃頂菊內(nèi)生菌的研究將為外來入侵雜草研究提供新的方向。另外，黃頂菊組織內(nèi)不可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌是否存在，以及是否對蘋果輪紋病菌具有拮抗效果有待進(jìn)一步研究。

蘋果輪紋病已成為我國蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要制約因子之一。生物防治作為新時期病害防治的研究熱點，在蘋果輪紋病的防治上由于受到技術(shù)、經(jīng)濟(jì)等原因并未大規(guī)模投入生產(chǎn)。因此，黃頂菊內(nèi)生菌對蘋果輪紋病的拮抗篩選研究可成為篩選經(jīng)濟(jì)、高效生防制劑的一部分，具有廣闊的市場前景。