李龍，劉樂荷，伍建榕，，蔣勇，馮立，趙霞

(1. 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2. 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3. 攀枝花市林業(yè)局森林病蟲害防治檢疫站，四川 攀枝花 617202)

車桑子Dodonaeaviscosa為無患子科Sapindaceae車桑子屬植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶、暖溫帶，中國(guó)主要分布在華南和西南地區(qū)。在云南金沙江干熱河谷中部?jī)砂?、福建南部、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、四川均有分布。車桑子是西南干熱河谷地區(qū)重要的本土樹種，對(duì)該地區(qū)植被恢復(fù)、水土保持、土壤有機(jī)碳含量提高具有重要作用[1]。

植原體phytoplasma原稱類菌原體(MLO)，是一類無細(xì)胞壁，存在于植物篩管細(xì)胞、介體昆蟲各個(gè)組織中的類似植物病原細(xì)菌，不能單獨(dú)培養(yǎng)的原核生物。植原體能引起許多林木、蔬菜、農(nóng)作物發(fā)病，給農(nóng)林生產(chǎn)造成重大損失，最近幾年發(fā)現(xiàn)比較多，并且有不斷增加的趨勢(shì)[2]。由植原體引起的病害能讓寄主產(chǎn)生以下幾種癥狀：主枝和側(cè)枝生長(zhǎng)受到抑制，腋芽和不定芽大量生長(zhǎng)，從而形成叢枝、矮化癥狀；葉片褪綠黃化，葉變小；花器發(fā)生變態(tài)；果實(shí)變小、畸形或不結(jié)實(shí)。在調(diào)查攀枝花林木病蟲害過程中發(fā)現(xiàn)車桑子叢枝病發(fā)生較為普遍，為了防止車桑子叢枝病發(fā)生面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，也為了更好地防治此種病害，利用已建立的PCR技術(shù)對(duì)在攀枝花采集的車桑子叢枝病株進(jìn)行了植原體檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增得到的植原體16S rDNA片段進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，并應(yīng)用林業(yè)有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系對(duì)車桑子叢枝病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查 在攀枝花市米易縣10個(gè)車桑子種植區(qū)進(jìn)行叢枝病調(diào)查，在每一種植區(qū)選擇50 m×50 m樣方，在樣方內(nèi)隨機(jī)選擇30株車桑子調(diào)查，記錄叢枝車桑子的株數(shù)。

1.2 基因檢測(cè)材料 車桑子叢枝病植株和無癥植株于2015年6月采自四川省攀枝花市米易縣草壩子車桑子種植區(qū)。同時(shí)在云南省紅河州建水縣和元陽縣采集無癥車桑子植株作為陰性對(duì)照，樣品均保存在-80 ℃冰箱。

1.3 車桑子叢枝病植原體的檢測(cè)

1.3.1 葉片總DNA提取 分別稱取0.1 g叢枝病植株和無癥狀植株的幼嫩葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒(OMEGA)(昆明碩陽科技有限公司)提取車桑子葉片的總DNA，并將DNA置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 引物及PCR反應(yīng)條件 利用植原體16S rDNA通用引物R16mF2 (5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′)/R16mRl(5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′)[3]為常規(guī)PCR引物，目的條帶為1 500 bp，然后以通用引物對(duì)R16F2(5′- ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′)和R16R2(5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA-3′)[3]為巢式PCR擴(kuò)增引物，預(yù)期產(chǎn)物為1 200 bp。常規(guī)PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中，2×Power Tap PCR MasterMix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)為10 μL，雙蒸水為7.8 μL，上下游引物各0.6 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)后在72 ℃條件下保持10 min，最后在PCR儀4 ℃條件下存放。待整個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)，其余放在-20 ℃保存?zhèn)溆?。以常?guī)PCR產(chǎn)物為反應(yīng)模板，以 R16F2/R16R2為擴(kuò)增引物，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增(其余反應(yīng)條件同常規(guī)PCR)。最后分別取PCR產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

1.4 核苷酸序列測(cè)定及分析 將含有目的片段的Nested-PCR產(chǎn)物送至昆明碩陽科技有限公司測(cè)序，將測(cè)得的16S rDNA基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載來自不同組的植原體，利用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析 林業(yè)有害生物(不含有害植物)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系[4-5]參照表1，風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式見表2。

表1 林業(yè)有害生物(不含有害植物)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系

續(xù)表

風(fēng)險(xiǎn)分析等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn) 風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值(R)分為4級(jí)，2.50≤R<3.00代表特別危險(xiǎn)，2.00≤R<2.50代表高度危險(xiǎn)，1.50≤R<2.00代表中度危險(xiǎn)，0≤R<1.50代表低度危險(xiǎn)。

表2 風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式

2 結(jié)果分析

2.1 車桑子在種植區(qū)的發(fā)病情況 車桑子叢枝病的癥狀表現(xiàn)為小葉、黃化、叢枝。感病植株的樹勢(shì)比正常植株弱，腋芽和不定芽大量生長(zhǎng)，形成叢枝、矮化癥狀(圖1)。

圖1 車桑子叢枝病株和健株癥狀比較

米易縣各車桑子種植區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，坊田鄉(xiāng)的車桑子感病率最高，達(dá)到53.4%，小麻柳坪的車桑子感病率最低，為16.7%(表3)。

表3 米易縣種植區(qū)車桑子感病率

2.2 PCR測(cè)序分析 分別以無癥和感病車桑子植株總DNA為模板，用R16mF2/R16mR2引物對(duì)進(jìn)行普通PCR，以及用R16F2/R16R2引物對(duì)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其中在攀枝花市米易縣采集的無癥和感病車桑子樣品中均獲得較亮的DNA片段，約1 200 bp，與Lee[3,6]等的結(jié)果相同，說明此種病原為系統(tǒng)侵染，而且植株中含有植原體病原；在云南省紅河州元陽縣和建水縣采集的無癥車桑子植株，并沒有發(fā)現(xiàn)約1 200 bp的DNA片段，說明了車桑子沒有被植原體侵染(圖2)。

注：M:2 000 bp Marker； 1-3.米易縣叢枝癥狀車桑子； 4-6.米易縣無癥車桑子； 7-8.建水縣無癥狀車桑子； 9-10.元陽縣無癥車桑子。

圖2車桑子叢枝植原體16SrDNA巢式PCR擴(kuò)增

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與同源分析 獲得的1條植原體DNA序列(登錄號(hào)：MG470796)與 GenBank中登錄的植原體各組中的代表性序列比較，并通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹)進(jìn)一步對(duì)比分析。車桑子叢枝病植原體與翠菊黃化病、柳葉菜屬叢枝病、藍(lán)莓叢枝病病原等16S rI-B組的各植原體株系在同一進(jìn)化枝上(圖3)。

圖3 用鄰接法構(gòu)建的車桑子叢枝病植原體16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析

2.4.1 有關(guān)分布 我國(guó)車桑子主要分布在云南金沙江干熱河谷中部?jī)砂叮怀酥?，?guó)內(nèi)的福建南部、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、四川均有分布。而車桑子叢枝病主要分布在我國(guó)干熱河谷地區(qū)。

2.4.2 潛在危害性 引起車桑子叢枝病的病原為植原體。植原體寄主范圍廣，危害嚴(yán)重；受害植物近千種，在我國(guó)由植原體引起的泡桐叢枝病、棗瘋病、苦楝叢枝病、桑萎縮病、萵苣黃化病等是一類毀滅性病害，長(zhǎng)期以來對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)作物和綠化樹種造成了巨大損失。

2.4.3 寄主植物的經(jīng)濟(jì)重要性 在我國(guó)干熱河谷地區(qū)，凡是車桑子生長(zhǎng)的地方均能發(fā)現(xiàn)車桑子叢枝病的存在。車桑子是我國(guó)干熱河谷地區(qū)植被恢復(fù)的重要樹種。車桑子叢枝病的蔓延將影響車桑子生長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)，從而威脅著我國(guó)干熱河谷地區(qū)的植被恢復(fù)。

2.4.4 傳播擴(kuò)散的可能性 車桑子叢枝病的傳播途徑主要有3種。一是木虱傳播。其靠飛行和借助風(fēng)力可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。二是接穗傳播。嫁接換種或育苗時(shí)，無意間選取了病樹上的接穗引起叢枝病傳播蔓延。三是苗木傳播。苗木從疫區(qū)調(diào)進(jìn)。種植了帶病苗木引起傳播蔓延。

2.4.5 危險(xiǎn)性管理難度 抗生素防治車桑子叢枝病有一定效果，考慮到車桑子叢枝病的發(fā)生面積較大、侵染來源較多，且該病具有隱癥現(xiàn)象，該病難以在短時(shí)間內(nèi)得到控制。

2.4.6 評(píng)估分析 綜合分布情況、潛在危害性、寄主植物的重要性、傳播擴(kuò)散的可能性和危害性管理難度等幾個(gè)方面的描述，對(duì)車桑子叢枝病的各個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)進(jìn)行賦分(表4)。

表4 車桑子叢枝病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)及賦值

續(xù)表

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式(表2)，對(duì)車桑子叢枝病進(jìn)行各項(xiàng)評(píng)判指標(biāo)和風(fēng)險(xiǎn)性R計(jì)算；其中分析區(qū)域內(nèi)分布情況P1=2.05；傳入、定殖和擴(kuò)散的可能性P2=2.277 2；潛在危害性P3=0.884；受害寄主經(jīng)濟(jì)重要性(受害對(duì)象的重要性)P4=2.0；危險(xiǎn)性管理難度P5=2.47；風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R=1.900 8，達(dá)到中度危險(xiǎn)級(jí)別。

3 結(jié)論與討論

利用植原體16S rDNA通用引物，對(duì)攀枝花市米易縣草壩子叢枝車桑子植株和健康車桑子植株進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出1.2 kb的特異條帶，在看似健康的車桑子葉片中都能檢測(cè)到植原體的存在，說明車桑子叢枝病存在潛伏期。測(cè)序序列均與植原體有同源性關(guān)系，且與植原體的16S rI-B亞組同源性最高；對(duì)云南紅河州兩縣的車桑子健康植株進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，沒有擴(kuò)增出1.2 kb的特異條帶，反應(yīng)米易縣車桑子叢枝病的危害程度較高；通過對(duì)攀枝花米易縣車桑子叢枝病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R=1.900 8，這種病害達(dá)到中度危險(xiǎn)級(jí)別。車桑子作為干熱河谷地區(qū)重要的固沙保土、植被恢復(fù)的重要樹種，車桑子叢枝病是危害車桑子的一種嚴(yán)重病害?；架嚿Ｗ訁仓Σ〉闹仓瓴荒芟衿渌魑镆粯又苯隅P除，因此相關(guān)部門應(yīng)該給予重視。為了控制這種病害蔓延，建議林業(yè)、農(nóng)業(yè)部門統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，協(xié)同防治，確保防治效果，把疫區(qū)控制在最小范圍。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹觀察可知，檢測(cè)序列屬于16S rI-B亞組，并且與翠菊黃化病、苦楝叢枝病、白蠟樹叢枝病等16S rI-B組各植原體株系在同一進(jìn)化枝上。于少帥 等[7]通過多位點(diǎn)序列分析將不同地區(qū)的苦楝叢枝分為4個(gè)進(jìn)化類群，而干熱河谷不同地區(qū)的車桑子叢枝是否也分為不同的類群還需進(jìn)一步研究。本次只研究米易縣的車桑子叢枝病，干熱河谷地區(qū)的車桑子叢枝病是否存在明顯的地區(qū)?；?，是否存在不同地區(qū)的遺傳多樣性，要回答這些問題還需通過擴(kuò)大樣品的檢測(cè)數(shù)量、測(cè)定核糖體蛋白(rp)基因、延伸因子(tuf)基因等較16S rDNA具有較大變異性的基因以獲得更多分子生物學(xué)信息來加以證實(shí)[8]。