李嬌洋,楊 帆,包 斌,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺,上海 201306；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院,內(nèi)蒙古鄂爾多斯 014300)

葉類蔬菜(以下簡稱葉菜),是指以菜葉和葉柄為食用部分的蔬菜。主要包括白菜類(大白菜、結(jié)球甘藍),綠葉菜類(菠菜、芹菜、油菜、香菜(芫荽)、生菜、空心菜(蕹菜)、木耳菜、薺菜、莧菜、茼蒿、烏塌菜、茴香)和蔥韭類(韭菜、蒜苗,芽菜類中的豌豆苗、菊苣芽、蕎麥芽、蘿卜芽、佛手瓜嫩梢)等21種葉類蔬菜[1]。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部“2016年我國蔬菜交易市場發(fā)展態(tài)勢分析”項目組對全國77個大中城市(城鎮(zhèn)常住人口過百萬)生產(chǎn)情況調(diào)查的不完全統(tǒng)計,2005～2012年蔬菜產(chǎn)量增加了27.0%。預(yù)計到2020年,我國蔬菜人均占有量每年400 kg,將成為世界蔬菜第一生產(chǎn)大國[1]。由于我國蔬菜產(chǎn)業(yè)鏈不完善,大部分地區(qū)仍采用直銷或是初加工的方式,導(dǎo)致我國蔬菜腐爛率極高,在運輸和銷售過程中,造成大量的浪費。故對葉菜的貯藏手段進行研究是不可或缺的。

葉菜采后已不能再從土壤中獲取養(yǎng)分,但仍進行著一系列復(fù)雜的生命活動,導(dǎo)致葉菜品質(zhì)發(fā)生不同程度的改變,而對這些變化的評價是選擇貯藏方法的重要依據(jù)。本文在概述葉菜貯藏期間生理和營養(yǎng)成分變化的基礎(chǔ)上,著重總結(jié)了反映以上變化的指標(biāo)及其析方法。

1 葉類蔬菜貯藏中的品質(zhì)變化的評價指標(biāo)

1.1 生理變化的評價指標(biāo)

蒸騰作用是果蔬表面失水的重要原因,水分通過果蔬表皮的角質(zhì)層、皮孔和氣孔散發(fā)出去[2]。當(dāng)水分散失超過果蔬重量5%時,果蔬就會出現(xiàn)萎蔫,并且失水還會影響正常的呼吸作用,使水解酶活力增強,糖酸類物質(zhì)的水解加速,加快了果蔬成熟和衰老的過程[2]。通過失重率可以直觀明了地評價葉菜在貯藏期間的蒸騰作用強弱(失水情況)。大部分的葉菜貯藏研究中,失重率均會作為評價指標(biāo)之一,監(jiān)測葉菜在貯藏過程中的失水情況。金文斌等[3]用乳酸鈣對鮮切菠菜進行處理,采用濃度為0.75%(最佳處理濃度)的乳酸鈣處理,在貯藏終點(第12 d)時,處理組的失重率顯著低于對照組(p<0.05),說明乳酸鈣能夠有效減緩鮮切菠菜在冷藏過程中的蒸騰作用。

呼吸作用是采后葉菜一個最基本的生理過程。葉菜采后,同化作用基本停止,呼吸作用成為新陳代謝的主導(dǎo)。呼吸作用直接、間接地聯(lián)系著各種生理生化過程,因此也影響著葉菜的耐貯性。呼吸作用越旺盛,各種過程變化越快,生命終止也就越早[2]。呼吸強度(用CO2的生成量表示)和乙烯釋放量是評價呼吸作用的兩個指標(biāo)。周偉[4]對低溫下單色LED和短波UV(UV-C)照射對上海青貯藏品質(zhì)調(diào)控進行了研究,對貯藏期間乙烯釋放量和呼吸強度分別進行了探討,結(jié)果顯示,在呼吸驟變期(第4 d),紅色LED和UV-C處理組的呼吸強度和乙烯釋放量顯著低于對照組(p<0.05)。

與此同時,貯藏期間葉菜中許多酶的活性也會發(fā)生變化,包括葉綠素酶、組織纖維素酶、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine lyase,PAL)。其中PAL是植物中催化苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶,蔬菜采收時不可避免會造成機械損傷,此時PAL被誘導(dǎo),促進多酚化合物的下游生物合成[5]。研究表明[6],當(dāng)蔬菜受到外界環(huán)境的干擾,如寒冷、機械損傷、紫外輻射等,體內(nèi)生理代謝中苯丙烷類代謝被激活,PAL活性會迅速上升,故采后蔬菜PAL活性會隨著貯藏時間的延長而升高。PPO與酚類化合物的相互作用是導(dǎo)致蔬菜褐變的生物化學(xué)反應(yīng)途徑的原因,PPO與多酚類物質(zhì)接觸,催化多酚類物質(zhì)氧化成鄰醌,再進一步氧化聚合成黑色素,最終導(dǎo)致色澤劣變[5]。Viacava等[7]采用天然化合物殼聚糖和茶樹精油分別對萵苣進行處理后在低溫(0～2 ℃)條件下進行品質(zhì)評估,結(jié)果顯示,殼聚糖和茶樹精油在貯藏期間均能抑制PPO和POD活性的上升,殼聚糖的效果更佳,在貯藏終點(第21 d)時,殼聚糖處理組的PPO和POD活性顯著(p<0.05)低于對照組。張艷芬[8]在低溫貯藏期間薺菜品質(zhì)和生理特性變化的研究中,以葉綠素酶、纖維素酶、SOD、PAL、POD的活性作為檢測指標(biāo),結(jié)果顯示,在0 ℃時,隨著貯藏時間的延長,葉綠素酶和纖維素酶的活性均呈先增長后下降的趨勢,SOD活性呈下降趨勢,PAL、POD活性呈上升趨勢,而PPO活性極弱,貯藏期間并無明顯變化。

電導(dǎo)率是電解質(zhì)由植物體釋放到水中的速度決定的,而電解質(zhì)的釋放與細胞膜結(jié)構(gòu)和透性的改變息息相關(guān)。隨著貯藏時間的延長,蔬菜受病原菌污染的可能性增大,細胞膜的通透性增加,電解質(zhì)溶出更多,電導(dǎo)率呈上升趨勢。王穎榮等[9]研究了低溫對自發(fā)氣調(diào)包裝雞毛菜保鮮效果的影響,分別在0、4、8、12 ℃下貯藏,并測定了電導(dǎo)率的變化,在貯藏終點(第14 d)時,0、4 ℃的電導(dǎo)率僅為7%,另外兩組為12%。

1.2 營養(yǎng)品質(zhì)變化的評價指標(biāo)

由于采后葉菜不再從土壤等外界獲取能量,隨著采后呼吸作用的進行,葉菜營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生了變化。其中葉綠素、維生素C、還原糖、酚類、可滴定酸等會隨著貯藏時間的增加而減少,導(dǎo)致葉菜出現(xiàn)褪綠、酸度增加等“亞健康”的狀態(tài)。因此葉綠素、維生素C、還原糖、酚類、可滴定酸度可以作為葉類蔬菜營養(yǎng)物質(zhì)變化的評價指標(biāo)。Ubeed等[10]研究了硫化氫熏蒸對采后白菜品質(zhì)的影響,測定了葉綠素、維生素C等指標(biāo)。

1.3 其他品質(zhì)變化的評價指標(biāo)

除了生理變化和營養(yǎng)品質(zhì)變化外,葉菜在貯藏中亞硝酸鹽[11]、菌落總數(shù)[12]、感官[13]以及色澤[14]方面也會發(fā)生明顯變化。隨著貯藏時間的延長,菌落總數(shù)和亞硝酸鹽的含量逐漸上升,感官評定的分數(shù)逐漸下降,色澤逐漸趨于黃褐色。

2 葉類蔬菜貯藏中品質(zhì)變化評價指標(biāo)的分析方法

2.1 生理變化指標(biāo)的分析方法

2.1.1 失重率 失重率指葉菜貯藏后與貯藏前的質(zhì)量差與貯藏前質(zhì)量的比值,乘以100,從而得到一個表示質(zhì)量變化的數(shù)值[15]。

2.1.2 呼吸強度和乙烯 測定呼吸強度的方法主要是靜置法[4,16]、氣流法[17]、氣相色譜法[18]以及紅外線CO2分析儀法[19-21]。靜置法和氣流法的原理相同,用定量堿液吸收蔬菜在一定時間內(nèi)呼吸所釋放出來的CO2,再用酸滴定剩余的堿,即可計算出呼吸所釋放出CO2量,求出其呼吸強度，以每公斤每小時釋放出來的CO2毫克數(shù)表示。相對氣流法來說,靜置法操作簡便、成本低,但耗時長、誤差較大,而氣流法操作稍顯繁瑣,但可以連續(xù)多次測定。紅外線CO2分析儀法是操作最為簡便的一種方法,故適于樣品量大,檢測次數(shù)多的樣品中,但該方法不能得到一定時間內(nèi)一定量蔬菜呼吸所產(chǎn)生CO2量的具體數(shù)值,只能得到CO2的百分含量,可以用于在貯藏期間監(jiān)測葉菜呼吸強度的變化。張桂[22]比較了靜置堿液吸收法和CO2分析儀法兩種方法測定果蔬呼吸強度的不同,結(jié)果顯示:靜置堿液吸收法測定果蔬的采后呼吸強度簡便,易行,儀器簡單,成本低,測定數(shù)據(jù)可以滿足需要的精確度;CO2分析儀測定法測定數(shù)據(jù)精確、可靠,快速,儀器使用方便。當(dāng)置信度為95%時,平均值的置信區(qū)間要比靜置堿液吸收法小,從而可以證明其測定的準確度高于靜置堿液吸收法。

測定乙烯釋放量的方法主要是氣相色譜法[16,23]。及雪良等[23]用氣相色譜法測定萵苣在貯藏期間的乙烯釋放量,使用Agilent 6890N型氣相色譜儀,氫離子火焰檢測器(Hydrogen ion flame detector,FID),色譜條件為柱溫45 ℃,色譜柱HP-5 Phenyl Methyl Siloxane,檢測器溫度250 ℃,燃氣H2流速40 mL/min,助燃空氣流速450 mL/min,載氣N2流速45 mL/min,不分流進樣,保留時間5 min,進樣量0.1 mL。

2.1.3 電導(dǎo)率 電導(dǎo)率的測定主要是采用電導(dǎo)率儀法[3,10]。電導(dǎo)率儀由振蕩器、電導(dǎo)池、放大器、指示器等部分組成,電極是電導(dǎo)率儀的重要組件,分為鉑黑電極和光亮電極,通常鉑黑電極用的比較多,它的表面積比較大,降低了電流密度,減少或消除了極化。但在測量低電導(dǎo)率溶液時,鉑黑對電解質(zhì)有強烈的吸附作用,出現(xiàn)了不穩(wěn)定的現(xiàn)象,這時宜用光亮電極[24]。

2.1.4 酶活 葉菜貯藏中活性發(fā)生變化的幾種酶的分析方法見表1。

表1 葉菜貯藏中酶活的分析方法

2.1.4.1 葉綠素酶 測定葉綠素酶活性的方法主要是紫外分光光度法。酶的提取條件和活性分析條件是測定時的主要影響因素。顧煒[44]在茶樹葉綠素酶的分離純化和性質(zhì)的初步研究中,對葉綠素酶提取條件和活性分析條件進行了優(yōu)化研究,結(jié)果顯示:當(dāng)聚乙烯吡咯烷酮加入量與樣品鮮重一致、緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、提取液pH為7.5時為最佳提取條件;最佳活性分析條件為反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時間15 min。

2.1.4.2 纖維素酶 測量纖維素酶活性的方法主要是羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC)糖化法和己糖激酶法。CMC糖化法適用于實驗室操作,而己糖激酶法適用于自動化(即在大型生化分析儀上測定)。孫盈等[27]研究和分析了羧甲基纖維素酶活性測定法的實驗條件,結(jié)果顯示,纖維素酶活力測定的最佳條件為:在酶促反應(yīng)溫度為40 ℃,pH6.2,底物濃度為10 g/L,粗酶液和底物添加量均為2 mL,酶促反應(yīng)時間30 min,測定波長520 nm。

2.1.4.3 超氧化物歧化酶(SOD) 檢測SOD活性的方法主要有氮藍四唑(Nitrogen blue tetrazole,NBT)光化還原法和鄰苯三酚法。鄰苯三酚法又稱作420 nm法,有較多的改良方法,例如325 nm法[45]、微量鄰苯三酚/維生素C終止劑法[46]、DTT終止劑法[47]等。近幾年來,NBT光化還原法得到了充分的發(fā)展,同傳統(tǒng)的比色法相比,化學(xué)發(fā)光法專一性較強、干擾因素少、靈敏度高,最適用于粗提取液中SOD活性的檢測[48]。曲敏等[49]對NBT光化還原法、鄰苯三酚自氧化法測定SOD酶活性分別從靈敏度、精確度、重現(xiàn)性三個方面進行了比較,在標(biāo)準品SOD酶活的測定中,鄰苯三酚自氧化法的精確度高于NBT光還原法,但靈敏度遠不及后者。在測定兩種植物(苜蓿草和番茄)SOD時,NBT光還原法具有穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好的特點,優(yōu)于鄰苯三酚自氧化法。故NBT光還原法是測定植物SOD及SOD標(biāo)準品酶活的理想檢測方法。

2.1.4.4 多酚氧化酶(PPO) 檢測PPO活性的方法主要有鄰苯二酚法和氧電極法。其中鄰苯二酚法使用更為廣泛,針對不同的樣品采用不同的鄰苯二酚改良法。馮佳麗等[35]以南燭葉為原料分別研究了交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)添加量、料液比、浸提時間和pH各因素對提取的PPO酶活的影響。結(jié)果顯示最佳條件為:9%的PVPP,料液比1∶15 g/mL,pH為7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol/L),4 ℃下浸提9 h,得到的最高酶活為11335 U/mL。也有研究表明[50]植物組織中SOD、POD活性受提取緩沖液pH影響,常用的緩沖液pH為6.0、7.0、7.8、5.5,SOD不適合在低pH6.0提取緩沖液下提取,POD不適合在pH7.0的提取緩沖液下提取,但二者均可在pH7.8的緩沖液中提取。

2.1.4.5 過氧化物酶(POD) 檢測POD活性的方法主要有愈創(chuàng)木酚法和鄰苯三酚自氧化法。二者操作難易程度相當(dāng),但愈創(chuàng)木酚法比鄰苯三酚法更加靈敏,故愈創(chuàng)木酚法是最常用的方法。劉揚[51]對養(yǎng)心菜POD活性的測定時間、pH、溫度進行了比較,結(jié)果表明:養(yǎng)心菜POD酶活測定時間應(yīng)選擇0～3 min內(nèi)吸光度的變化,養(yǎng)心菜POD最適pH為5.5,最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.1.4.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL) 檢測苯丙氨酸解氨酶的方法主要是聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)法,采用硫酸銨做沉淀劑。曹錦萍等[52]研究了硫酸銨一次沉淀法和分級沉淀法對苯丙氨酸解氨酶活性測定的影響,結(jié)果顯示,一次沉淀法產(chǎn)率高,產(chǎn)率越高則活性越高,而分級沉淀法產(chǎn)率較低,但可去除大部分的雜蛋白,且純化倍數(shù)高。

2.2 營養(yǎng)成分的分析方法

葉菜貯藏中各種營養(yǎng)成分的分析方法見表2。

表2 葉菜貯藏中營養(yǎng)成分的分析方法

2.2.1 葉綠素 葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法。目前應(yīng)用最為廣泛的是紫外分光光度法。研究者對提取劑的優(yōu)化選擇也是常見的研究之一。任紅等[71]對5種提取劑提取菜心葉綠素進行了研究,分別是95%乙醇、80%丙酮、丙酮∶乙醇=1∶1、丙酮∶乙醇=1∶2和丙酮∶乙醇=2∶1,結(jié)果顯示,乙醇法提取時間長,對木本植物提取效果差;丙酮法提取液中葉綠素易受光氧化破壞,使測定值偏低,故不適合用于測量數(shù)量多的樣品;混合液提取法中,丙酮∶乙醇=2∶1提取法的葉綠素的提取率和提取液的穩(wěn)定性最佳,可以快速測定大批量樣品的葉綠素含量。

2.2.2 維生素C 維生素C含量測定方法主要有高效液相色譜法、熒光分析法、2,6-二氯靛酚滴定法。其中2,6-二氯靛酚滴定法對操作人員要求較高,當(dāng)樣品顏色較深時,會影響對滴定終點的判斷。于玲等[72]分別采用紫外可見分光光度法、熒光法和高效液相色譜法對7個不同產(chǎn)區(qū)酸棗仁中的維生素C含量進行了測定,結(jié)果顯示,三種方法的測定結(jié)果差異不大,但高效液相色譜法較其他兩種方法精密度高,準確性好,操作步驟簡單。鄭清嶺等[63]采用不同的方法對沙芥屬蔬菜(沙芥和斧形沙芥)植物維生素C的含量進行了測定,結(jié)果顯示:滴定法和熒光法的回收率無明顯差異,但熒光法比滴定法的精確度高,因此,熒光法比滴定法更佳。Santosa等[73]將超聲波提取與LC-MS/MS和LC-DAD相結(jié)合,以量化薄荷、菠菜等12種鮮切蔬菜中的游離維生素含量。

2.2.3 還原糖 還原糖含量測定方法主要有GB/T 5000.7-2008[74]中規(guī)定的直接滴定法、3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)和鐵氰化鉀-三氯化鐵光度法。直接滴定法適用性強,但操作繁瑣,對滴定終點判斷困難,容易存在人為誤差。3,5-二硝基水楊酸比色法是半微量定糖法,操作簡便、快捷,雜質(zhì)干擾較少,適合批量測定,是目前實驗室測定還原糖最常用的方法。李志霞等[75]用響應(yīng)面法對3,5-二硝基水楊酸比色法測定水果中還原糖含量條件進行了優(yōu)化,結(jié)果顯示,影響DNS法測定還原糖含量的因素主次順序為:DNS用量>反應(yīng)溫度>顯色時間。DNS法測定還原糖含量的最佳條件為:DNS用量4.0 mL,顯色時間5.0 min,反應(yīng)溫度87.0 ℃。

2.2.4 可滴定酸 可滴定酸含量測定方法主要是酸堿滴定法?？傻味ㄋ嵋兹苡谒鸵掖?浸出液呈酸性,可用氫氧化鈉標(biāo)準溶液滴定,以酚酞為指示劑,通過消耗的氫氧化鈉體積計算出可滴定酸的含量。

2.2.5 酚類物質(zhì) 測定酚類物質(zhì)含量的方法有比色法(亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉為顯色劑)和高效液相色譜法。比色法可以測定樣品中的總酚含量,高效液相色譜法可同時測量多個酚類物質(zhì),且分離度較好。操作簡便、精確,色譜條件[76]為:流動相:甲醇和4%醋酸(27∶73),柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min,紫外檢測器波長313 nm。

2.3 其他指標(biāo)的分析方法

2.3.1 菌落總數(shù) 測量菌落總數(shù)的方法主要有平板菌落計數(shù)法[77-78]、菌落總數(shù)測試片法[79]和TTC瓊脂培養(yǎng)基檢測法[80]。李光澤[81]對食品微生物檢驗菌落總數(shù)測定方法的效果進行了比較分析,結(jié)果顯示,與測試片及平板技術(shù)法相比,TTC法對于菌落總數(shù)超標(biāo)樣品的檢出率更高、靈敏度更好。

2.3.2 亞硝酸鹽 測定亞硝酸鹽含量的方法很多,主要有以下幾大類:Griess試劑比色法[82]、酚二磺酸比色法[83]、高效液相色譜法[84]、離子色譜法[85]和毛細管電泳法[86]等。毛細管電泳法由于其設(shè)備普及性強,高靈敏度和選擇性,低檢測限[87],而備受國內(nèi)外很多研究者的青睞。

2.3.3 感官評定 感官評定是通過主觀評判的一個指標(biāo),對于不同的葉菜,評定的細則有一定差異,通常包括顏色、氣味、形態(tài)、質(zhì)地等。感官評定[88-89]也被作為葉菜貯藏期間一個和商業(yè)價值關(guān)系最密切的指標(biāo)。

2.3.4 色澤 色澤除在感官評定中被評價外,最常用的客觀評價方法是色差儀法[90]。在植物花、葉等測色研究中通常采用基于色空間(Color space)的儀器測色法,即利用色差儀在自帶特定光源條件下測量色差指標(biāo)值,但是由于測色儀鏡口與茶樹葉片大小之間的不對等性,使得在實際操作過程中會出現(xiàn)由于葉面積太小導(dǎo)致近似漏光、單葉多點重復(fù)測色難以實現(xiàn)等諸多不足?？紫槿鸬萚91]使用掃描儀、Color Pix等組件構(gòu)成的測色裝置,卻可以避免上述缺點,這對于特異葉色或花斑葉色材料的鑒定,以及觀賞性植物的花色測定、果蔬類葉病監(jiān)測等均具有實際應(yīng)用價值。

3 總結(jié)與展望

國內(nèi)外對葉菜的貯藏研究越來越重視,貯藏方法的效果需要通過品質(zhì)變化評價指標(biāo)進行分析。傳統(tǒng)的貯藏手段已經(jīng)不能滿足人們對葉菜貯藏過程中保持色、香、味等方面的需求,故隨著保鮮手段的日益豐富,貯藏過程中生理變化和營養(yǎng)品質(zhì)變化的評價顯得尤為重要。本文綜述了葉菜貯藏過程中品質(zhì)變化評價指標(biāo)及其分析方法。為葉菜保鮮向著越來越好的方向發(fā)展提供參考。同時,葉菜貯藏期間,若能利用新方法和新技術(shù)同時測定多個指標(biāo),則效率將會大幅提高,因此可把多指標(biāo)同時檢測作為未來指標(biāo)分析方法的研究方向。