儲 雪,黃玉軍,陳 霞,印伯星,陳大衛(wèi),顧瑞霞

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225127)

國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新數(shù)據(jù)顯示[1],2017年全世界有 4.25億糖尿病患者,其中Ⅱ型糖尿病占比超過90%。Ⅱ型糖尿病是胰島素抵抗或胰島素分泌不足引起的以血糖升高為特征的內(nèi)分泌代謝病。其主要病征為多尿癥、多飲癥以及多食癥。長期的糖尿病可引起胰島素抵抗或胰島素分泌不足以及靶細(xì)胞對胰島素的敏感性降低,進(jìn)而擾亂機(jī)體代謝,甚至引起心血管疾病、腎臟病變、神經(jīng)病變等并發(fā)癥[2]。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明乳酸菌及其制品對于糖尿病有一定的輔助治療作用,其機(jī)制涉及提高腸道黏膜屏障功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、修復(fù)機(jī)體氧化損傷、促進(jìn)胰島素分泌、促進(jìn)機(jī)體對葡萄糖的吸收利用等[3]。目前市場上所銷售的絕大多數(shù)發(fā)酵乳使用蔗糖作為甜味劑,而蔗糖的攝入會(huì)導(dǎo)致糖尿病人血糖升高;使用代糖(如木糖醇、三氯蔗糖等)制備的發(fā)酵乳雖然可以降低糖尿病人血糖升高的風(fēng)險(xiǎn),但此類產(chǎn)品存在乳酸菌活力減弱、口味單一、安全性不明等問題[4-5]。因此,利用天然非營養(yǎng)型甜味料開發(fā)一款既具有蔗糖發(fā)酵乳風(fēng)味,又不含蔗糖的發(fā)酵乳,能在不引起糖尿病人血糖升高的同時(shí)兼具有傳統(tǒng)發(fā)酵乳的營養(yǎng)和功能特性。

羅漢果和甘草是我國特有的植物資源,其中含有的羅漢果甜苷和甘草甜素是天然的非營養(yǎng)型甜味物質(zhì),其中的黃酮和皂苷類物質(zhì)也已被證實(shí)具有一定的輔助降糖作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過浸提羅漢果和甘草中的主要甜味成分(羅漢果甜苷和甘草甜素),輔以木糖醇等非營養(yǎng)型甜味劑制備的天然非營養(yǎng)型甜味料取代蔗糖制備發(fā)酵乳,在保證感官品質(zhì)的基礎(chǔ)上,研究天然非營養(yǎng)型甜味料發(fā)酵乳對于四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠一般癥狀和其機(jī)體糖代謝的影響,以期為甜味料在發(fā)酵乳及其他食品加工中的應(yīng)用和開發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

雄性Wistar大鼠60只,體重(170±20) g 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號 SCXK(蘇)2017-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0044;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)S7 江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;吡啶甲酸鉻(500 μg/片) 普瑞丁健康食品公司;羅漢果、甘草、木糖醇、赤蘚糖醇、甜菊糖苷、甘草甜素 市售;四氧嘧啶 索萊寶生物科技有限公司;胰島素(INS)試劑盒 南京建成生物研究所;血糖(GLU)試劑盒、糖化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒 寧波美康生物科技股份有限公司。

日立7050生化分析儀 南京三和儀器有限公司;GA-3型血糖儀及血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司;全自動(dòng)微機(jī)量熱儀 民生科技開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將實(shí)驗(yàn)菌株參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行活化。

1.2.2 天然非營養(yǎng)型甜味料的制備 按專利[9]方法,原料經(jīng)粉碎后,羅漢果按1∶35的料液比80 ℃水提3次共60 min,甘草按1∶40的料液比90 ℃水提2次共90 min,取羅漢果和甘草水提液的濾后上清液,與甜菊糖苷、甘草甜素、木糖醇、赤蘚糖醇復(fù)配、濃縮而成,甜度約為蔗糖的2～4倍,利用感官品評測定其甜度。

1.2.3 發(fā)酵乳的制備 參照文獻(xiàn)[10]的工藝制備發(fā)酵乳,其中天然非能量型甜味料發(fā)酵乳中添加方法1.2.2所制備的甜味料,甜度與6%(w/w)蔗糖甜度相當(dāng);蔗糖發(fā)酵乳中添加6%(w/w)蔗糖;無甜味劑發(fā)酵乳中不添加任何甜味劑,其他工藝均相同。

1.2.4 發(fā)酵乳感官及理化指標(biāo)的測定 感官評價(jià)人員為具有食品專業(yè)背景的本科生及研究生共30名,按國標(biāo)[11]相關(guān)指標(biāo)測定標(biāo)準(zhǔn)測定,其中感官指標(biāo)以定量法測定。能量值利用全自動(dòng)微機(jī)量熱儀測定。

1.2.5 糖尿病大鼠模型建立 采用腹腔注射造模[12],大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后禁食不禁水16 h,分兩次腹腔注射四氧嘧啶120 mg/(kg·bw)后,兩次間隔24 h,于末次注射后第4 d對小鼠禁食不禁水12 h,尾靜脈取血測定其空腹血糖值。血糖值高于11.1 mmol/L即造模成功。

1.2.6 動(dòng)物分組及喂養(yǎng) 大鼠自由飲水?dāng)z食。造模成功后開始灌胃,空白組和模型組灌胃生理鹽水,陽性對照組灌胃1%(w/w)吡啶甲酸鉻水溶液,發(fā)酵乳各組灌胃對應(yīng)發(fā)酵乳;每組10只大鼠,灌胃量為2 mL/100 g·bw,連續(xù)灌胃4周,記錄大鼠體重、攝食量及飲水量。

1.2.7 血糖的測定 分別于灌胃0、4、8、12、16、20、24和28 d禁食8 h后尾靜脈針刺法[8]采血,用血糖儀測定血糖水平。

1.2.8 糖耐量(OGTT)的測定 灌胃28 d 末次給予樣品15～20 min后以葡萄糖2.0 g/kg·bw灌胃,于0、0.5及2.0 h分別測定血糖值,并計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)[13]。

1.2.9 血清指標(biāo)(GLU、INS、HbA1c)的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,禁食不禁水12 h,摘除眼球取血,靜置0.5 h后分離血清,取上清液并按試劑盒操作說明測定。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 利用GraphPad Prism 6.0軟件和Oringin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳感官及理化指標(biāo)比較

如表1所示,三種發(fā)酵乳在色澤、組織狀態(tài)方面無顯著性差異(p>0.05),無甜味劑發(fā)酵乳的滋味和氣味顯著低于天然非能量型甜味料發(fā)酵乳和蔗糖發(fā)酵乳(p<0.05),主要是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵產(chǎn)酸,而無甜味劑發(fā)酵乳中并未添加甜味物質(zhì),酸甜不適口所致;理化指標(biāo)中,三種發(fā)酵乳在脂肪、蛋白質(zhì)含量和酸度方面無明顯差異,蔗糖發(fā)酵乳中非脂乳固體含量顯著高于天然非能量型甜味料發(fā)酵乳和無甜味劑發(fā)酵乳(p<0.05),主要是因?yàn)槠涮砑恿苏崽?三種發(fā)酵乳的活菌數(shù)無顯著性差異(p>0.05),天然非能量型甜味料發(fā)酵乳與無甜味劑發(fā)酵乳的能量值明顯低于蔗糖發(fā)酵乳組(p<0.05),說明利用天然非營養(yǎng)型甜味料取代蔗糖用于制備發(fā)酵乳,除了影響產(chǎn)品的非脂乳固體含量及能量外,在感官品質(zhì)與理化指標(biāo)上并無明顯差異。

表1 發(fā)酵乳感官及理化指標(biāo)的比較

2.2 發(fā)酵乳對大鼠飲水量和攝食量的影響

如圖1所示,四氧嘧啶誘導(dǎo)造模后,由于血糖升高導(dǎo)致血漿滲透壓升高,機(jī)體能量代謝異常,糖尿病大鼠飲水?dāng)z食量顯著增加(p<0.05)。陽性對照組干預(yù)后,糖尿病大鼠飲水、攝食量下降最快,說明吡啶甲酸鉻干預(yù)后可以快速有效地緩解由四氧嘧啶誘導(dǎo)產(chǎn)生的多飲多食癥狀。灌胃發(fā)酵乳干預(yù)后,糖尿病大鼠的飲水量和攝食量出現(xiàn)不同程度的下降(p<0.05),干預(yù)4周后,糖尿病組大鼠攝食量與空白組無顯著性差異(p>0.05),說明發(fā)酵乳的攝入可以有效改善糖尿病大鼠多食多飲的癥狀。

圖1 各組大鼠飲水和攝食量的比較

2.3 天然非營養(yǎng)型甜味料發(fā)酵乳對大鼠體重的影響

如表2所示,四氧嘧啶誘導(dǎo)造模后,四氧嘧啶能選擇性地作用于大鼠胰腺β細(xì)胞,導(dǎo)致β細(xì)胞不可逆壞死,形成大鼠糖尿病,同時(shí)造成機(jī)體糖脂代謝失調(diào),進(jìn)而引起負(fù)氮平衡,使得大鼠體重下降[14]。與模型組相比,發(fā)酵乳處理組大鼠體重呈現(xiàn)出不同程度的增長,其中蔗糖發(fā)酵乳處理組大鼠的體重增幅最為明顯,這是因?yàn)槿樗峋捌浯x產(chǎn)物的生理活性使機(jī)體代謝得到一定程度的恢復(fù),而蔗糖發(fā)酵乳處理組機(jī)體能量攝入較高,發(fā)酵乳中有機(jī)酸促進(jìn)機(jī)體消化吸收。

表2 各組大鼠體重變化的比較(x±SD,n=10)

2.4 天然非營養(yǎng)型甜味料發(fā)酵乳對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

由表3可知,與空白組大鼠相比,模型組大鼠空腹血糖明顯上升(p<0.05),說明模型組血糖代謝異常,而陽性對照組可以顯著降低其空腹血糖水平(p<0.05)。與模型組相比,各發(fā)酵乳干預(yù)組大鼠的血糖值從干預(yù)1周后開始顯著下降(p<0.05),組間差異不明顯,下降趨勢為:無甜味劑發(fā)酵乳組>天然非能量型甜味料發(fā)酵乳組>蔗糖發(fā)酵乳組,干預(yù)4周后天然非能量型甜味料發(fā)酵乳組大鼠空腹血糖與無甜味劑發(fā)酵乳組和陽性對照組無顯著差異(p>0.05),說明使用天然甜味料取代蔗糖制備發(fā)酵乳,可以降低血糖水平,長期干預(yù)效果與陽性對照(吡啶甲酸鉻)相近。

表3 各組大鼠空腹血糖的比較(x±SD,n=10)

2.5 天然非營養(yǎng)型甜味料發(fā)酵乳對大鼠糖代謝各項(xiàng)指標(biāo)的影響

由表4可知,與空白組相比,模型組大鼠INS水平顯著降低,AUC、HbA1c和HOMA-IR水平顯著升高(p<0.05),說明四氧嘧啶腹腔注射導(dǎo)致大鼠胰島素分泌不足,進(jìn)而形成胰島抵抗增強(qiáng),口服葡萄糖后血糖水平不能實(shí)現(xiàn)自體調(diào)節(jié)。與模型組相比,各發(fā)酵乳組大鼠的INS水平顯著提高(p<0.05),AUC、HbA1c和HOMA-IR水平下降,說明灌胃發(fā)酵乳后促進(jìn)了糖尿病胰島素的分泌,一定程度地減輕了胰島抵抗,降低了血糖水平。各發(fā)酵乳組之間無顯著性差異,說明糖尿病大鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化主要受到發(fā)酵乳的影響;與陽性對照組相比,天然非能量型甜味料發(fā)酵乳組各項(xiàng)糖代謝指標(biāo)均無顯著差異(p>0.05),而蔗糖發(fā)酵乳組的AUC和INS水平、無甜味劑發(fā)酵乳組的AUC水平與陽性對照組差異顯著(p<0.05),說明添加有甜味料的發(fā)酵乳能更好地調(diào)節(jié)糖代謝,這可能與甜味料中的黃酮、皂苷類物質(zhì)的生理活性相關(guān)[7]。

表4 各組大鼠AUC、HbA1C、INS和HOMA-IR的比較(x±SD,n=10)

3 結(jié)論與討論

高血糖是糖尿病的主要病理指征之一,本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射四氧嘧啶,破壞大鼠胰島β細(xì)胞減少胰島素分泌,使得大鼠空腹血糖明顯升高,攝食量、飲水量增加,體重減輕,說明糖尿病模型建立成功。陽性對照組采用吡啶甲酸鉻,其降糖機(jī)理是因?yàn)槠渲械娜齼r(jià)鉻是葡萄糖耐受因子(GTF)的重要組成成分,可以增加胰島素的活性,從而改善因胰島素分泌不足導(dǎo)致的糖代謝紊亂[15]。

乳酸菌的降血糖作用與乳酸菌種類及其干預(yù)時(shí)長有關(guān)[16]。Huang等[17]連續(xù)8周給高血糖動(dòng)物灌胃植物乳桿菌K68,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體的空腹血糖和胰島素水平均恢復(fù)至接近正常水平。本實(shí)驗(yàn)利用植物乳桿菌S7制備了三種發(fā)酵乳,灌胃4周后發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血糖均恢復(fù)至20.20 mmol/L以下,胰島素水平恢復(fù)到11.72 mIU/L以上,口服糖耐量恢復(fù)至45以下,與前人的研究結(jié)果一致,說明發(fā)酵乳對于機(jī)體糖代謝的恢復(fù)具有一定的輔助作用。

羅漢果和甘草具有黃酮、多糖、皂苷等活性成分,這些活性物質(zhì)可以抑制小腸中α-葡萄糖苷酶的活性,使得碳水化合物消化吸收減慢,從而降低空腹血糖[6-7]。Lee等[18]通過鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型,驗(yàn)證了羅漢果作為糖替代品的作用,結(jié)果表明與模型組相比,羅漢果提取物干預(yù)后,小鼠血糖升高率降低,口服糖耐量降低;Veerabhadrappa等[19]通過給四氧嘧啶誘糖尿病大鼠模型灌胃甘草及甘松提取物,結(jié)果呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,灌胃200 mg/kg·bw甘草提取物對大鼠血糖水平降低最明顯。本實(shí)驗(yàn)中取得了與前人研究一致的結(jié)果,與之不同的是本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的灌胃樣品為天然非營養(yǎng)型甜味劑制備的發(fā)酵乳樣品,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)發(fā)酵乳,該發(fā)酵乳樣品對糖尿病大鼠的糖代謝具有明顯的改善,對于甜味料相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

本研究中發(fā)現(xiàn)利用天然非營養(yǎng)型甜味料制備發(fā)酵乳,在維持發(fā)酵乳良好感官的基礎(chǔ)上具有更佳的降血糖作用,但其中成分復(fù)雜,具體作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,仍然有待進(jìn)一步研究探討。