楊勤，楊德全，龔偉（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心，重慶404120）

狼毒大戟是大戟科狼毒屬植物的干燥根，性味辛、平，有大毒[1]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其具有“主咳逆上氣，破積聚，飲食，寒熱，水氣，惡瘡，鼠瘺疽蝕，蠱毒”等功效。臨床上已有大量報(bào)道證明狼毒大戟對(duì)肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤有獨(dú)特療效，但其抗癌機(jī)制尚未明確[2-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)狼毒大戟對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等方面的影響，探討狼毒大戟抑制肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化（EMT）的機(jī)制，為進(jìn)一步研發(fā)該藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97H購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)。

1.1.2 藥物 狼毒大戟采自云南香格里拉，經(jīng)大理大學(xué)張德全副教授鑒定為大戟科狼毒大戟的干燥根。

1.1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)于Hyclone公司。胎牛血清購(gòu)于Lonsera公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)于 Corning公司?？谷薊-cadherin單抗（ab40772）和抗人Vimentin單抗（ab92547）購(gòu)于 Abcam公司。β-actin購(gòu)于 Genetex公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G（IgG）購(gòu)于中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97H采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 狼毒大戟活性部位的提取分離 取干燥狼毒大戟生品200 g，粉碎，過(guò)60目篩，用95%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，得狼毒生品的總提取物。用少量水將浸膏分散，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取多次至各有機(jī)相無(wú)色，合并萃取液，揮干溶劑得各極性部位石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇浸膏。分別稱取狼毒大戟提取物1 g，加入DMSO使其完全溶解（體積分?jǐn)?shù)小于0.1%），定容至刻度，制成供試品母液，在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌過(guò)濾，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成所需質(zhì)量水平。

1.2.3 MTT法檢測(cè)狼毒大戟不同提取部位對(duì)MHCC97H增殖的影響 試驗(yàn)分為對(duì)照組、不同提取部位給藥組。對(duì)照組是接種細(xì)胞但不加入藥物，不同提取部位給藥組是在各個(gè)提取部位不同水平梯度的含藥培養(yǎng)液中孵育細(xì)胞。取狼毒大戟乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯仿等4個(gè)提取部位的母液，用培養(yǎng)液配制成以下水平梯度：31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成5×105mL?1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，換成含有上述不同水平藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO震蕩10 min，通過(guò)酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 為排除藥物細(xì)胞毒作用對(duì)細(xì)胞EMT的影響，后續(xù)試驗(yàn)選用乙酸乙酯部位和正丁醇部位的 3 個(gè)水平值（125、250、500 μg/mL）作用 24 h后作深入研究，將其作為乙酸乙酯組和正丁醇組。取24孔板，用標(biāo)記物筆在板底均勻劃?rùn)M線作為標(biāo)記，每孔加5×105mL?1細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗去掉落的細(xì)胞，加入乙酸乙酯組和正丁醇組的稀釋液（終水平為125、250、500 μg/mL），用含 1%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)，24 h 后鏡下拍照，每組取5個(gè)視野拍照，測(cè)定各劃痕在0、24 h的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移的距離，用愈合率代表愈合能力。

1.2.5 細(xì)胞遷移試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97H肝癌細(xì)胞，用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液水平為 1×106mL?1，在 Tranwell小室上室中加入乙酸乙酯組和正丁醇組不同水平稀釋液的細(xì)胞懸液0.1 mL，下室加入0.6 mL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組種3個(gè)復(fù)孔，將Transwell小室的24孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，用棉簽去除上室中殘留細(xì)胞，置于200×顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，Matrigel膠稀釋液均勻鋪在Transwell小室底部，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)成膠后取出，細(xì)胞接種和藥物添加同1.2.5項(xiàng)，培養(yǎng)24 h后，棄去上室液體，用4%多聚甲醛固定15 min，用棉簽去除上室中殘留細(xì)胞，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，置于200×顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá) 不同水平的狼毒大戟乙酸乙酯組和正丁醇組處理MHCC97H肝癌細(xì)胞24 h，常規(guī)消化細(xì)胞后用冰PBS洗滌2次，加入裂解液裂解細(xì)胞，離心提取細(xì)胞總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白水平，并根據(jù)蛋白提取物水平確定上樣量。取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），轉(zhuǎn)膜后，NC膜用封閉液封閉1 h，分別加入一抗 E-cadherin（1∶1 500）、Vimentin（1∶2 500），4 ℃過(guò)夜。TBST 洗滌 4次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育 1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光，經(jīng)凝膠成像儀顯影，測(cè)定灰度值。以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用 分別處理24、48、72 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組水平在 31.25～1 000.00 μg/mL時(shí)對(duì) MHCC97H細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性，且乙酸乙酯組對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯高于正丁醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1。石油醚部位與氯仿部位對(duì)MHCC97H無(wú)明顯抑制作用。

2.2 狼毒大戟提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率的影響 劃痕24 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組MHCC97H細(xì)胞的遷移距離小于對(duì)照組，遷移能力受到明顯抑制。正丁醇組在125 μg/mL時(shí)愈合率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；乙酸乙酯組和正丁醇組各水平的愈合率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。乙酸乙酯組各水平愈合率與正丁醇組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 MTT法檢測(cè)狼毒大戟提取部位對(duì)MHCC97H肝癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 狼毒大戟提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率的影響

2.3 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 細(xì)胞遷移試驗(yàn)顯示，培養(yǎng)24 h后，乙酸乙酯組和正丁醇組穿過(guò)小室濾膜的遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；乙酸乙酯組和正丁醇組各水平遷移細(xì)胞數(shù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示，隨著乙酸乙酯和正丁醇水平的增加，穿過(guò)基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。見圖3、4。

圖3 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞遷移的影響

圖4 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞侵襲的影響

2.4 狼毒大戟提取部位對(duì)MHCC97H肝癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響 在狼毒大戟提取部位干預(yù)后，MHCC97H肝癌細(xì)胞中，乙酸乙酯組和正丁醇組的Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而E-cadherin的蛋白表達(dá)水平均逐漸上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 5、6。

圖5 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

圖6 狼毒大戟各提取部位對(duì)MHCC97H細(xì)胞Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌轉(zhuǎn)移是嚴(yán)重影響預(yù)后的重要因素[5]。EMT是上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過(guò)細(xì)胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型的過(guò)程。EMT與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，是近年來(lái)抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[6-8]。其中E-cadherin是EMT的特異性標(biāo)志物之一，其表達(dá)水平降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力減低，遷移能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，抑制Vimentin的表達(dá)可以減弱腫瘤細(xì)胞遷移能力[10]。

中醫(yī)認(rèn)為，肝癌的病理特點(diǎn)在于肝失疏泄，導(dǎo)致氣滯血瘀，氣郁化火，日久可成熱毒，熱毒內(nèi)蘊(yùn)，漸成癥瘕，故“以毒攻毒”是中醫(yī)治療癌癥的重要方法。臨床應(yīng)用有毒中藥治療腫瘤已經(jīng)取得較好的療效，從中挖掘提取有效的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前研究的趨勢(shì)[11-12]。狼毒大戟作為一種有毒的中藥，主要含萜類、苯乙酮類、鞣質(zhì)類、甾醇、揮發(fā)油等成分[13]?，F(xiàn)代藥理研究表明，其有效成分具有抗腫瘤活性[14]。簡(jiǎn)白羽等[15]報(bào)道，狼毒大戟中的沒(méi)食子酸乙酯體外試驗(yàn)?zāi)芤种迫私Y(jié)腸癌LOVO細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞的增殖。楊柯等[16]試驗(yàn)表明，狼毒大戟提取液能明顯促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的凋亡，將細(xì)胞周期阻滯在S期，并能明顯促進(jìn)Bax mRNA，抑制Bcl-2mRNA的表達(dá)。姜紅[17]報(bào)道，腹腔注射狼毒大戟提取液，連續(xù)7 d，能明顯抑制小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)抑制增殖細(xì)胞抗原（PCNA），進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。目前的研究主要圍繞狼毒大戟對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，但對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用及機(jī)制研究較少。

本研究選擇了高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株MHCC97H細(xì)胞來(lái)檢測(cè)狼毒大戟對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。MTT結(jié)果表明，乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，且乙酸乙酯提取部位的抑制作用明顯強(qiáng)于正丁醇提取部位，證明乙酸乙酯提取部位有明顯的抗腫瘤活性。劃痕試驗(yàn)和Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，乙酸乙酯組和正丁醇組干預(yù)后，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，同時(shí)檢測(cè)到標(biāo)志性蛋白分子E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin表達(dá)下調(diào)，提示兩者的干預(yù)能夠抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，狼毒大戟乙酸乙酯和正丁醇提取部位能夠抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而降低肝癌侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率，發(fā)揮其抗腫瘤的藥性。乙酸乙酯提取部位是狼毒大戟治療肝癌的重要生物活性成分，值得進(jìn)一步研究。