張小芳，付大友

(四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000)

近年來，隨著消費(fèi)者對食品安全問題的日益關(guān)注，食品中的各種添加劑受到人們越來越多的重視。人工合成的甜味劑和防腐劑作為食品添加劑被廣泛地應(yīng)用在各類食品中，但過量使用會對人體造成危害，因此，對它們的使用必須進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控[1，2]。目前，我國對食品中防腐劑和甜味劑的使用限量做了明確的規(guī)定，建立食品中防腐劑和甜味劑的含量準(zhǔn)確測定方法是十分重要的。

食醋和醬油是我國常用的調(diào)味品，山梨酸、脫氧乙酸、苯甲酸以及對羥基苯甲酸乙酯是醬油和食醋中最常見添加的防腐劑，為改善口感，向食醋和醬油中加入少量的甜味劑如糖精鈉、安賽蜜等用于調(diào)味。為保證消費(fèi)者的健康，建立一種快速、簡便的檢測醬油和食醋中防腐劑和甜味劑的方法十分必要。目前對醬油和食醋中防腐劑和甜味劑的檢測在國標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法中均有明確的使用要求，主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、離子色譜法等[3-18]。但絕大部分方法都只能同時檢測幾種添加劑，且前處理和液相分離條件復(fù)雜。本文建立一種高效液相色譜法梯度洗脫同時測定醬油和食醋中山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、糖精鈉、安賽蜜的方法，該方法前處理簡單、靈敏度高、精密度、準(zhǔn)確度好，有利于提高實(shí)驗(yàn)室的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1100 Series型液相色譜儀(紫外可見光檢測器)； AR1140分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；H1650R離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.1.2 試劑

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜(1 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)；脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯 (99%，天津博迪化工有限公司)；乙酸銨、亞鐵氰化鉀、鹽酸、乙酸鋅(分析純)；甲醇(色譜純)；實(shí)驗(yàn)室用水，均為二級蒸餾水；微孔濾膜0.22 μm;食醋和醬油，市售。

1.2 色譜條件

Welch Xtimate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm；流動相為甲醇(A)∶0.02 mol/L的乙酸銨溶液(B)。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯各0.1000 g于100 mL的容量瓶中用甲醇定容，每種標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度為1.000 mg/mL。然后分別取各種標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL于50 mL的容量瓶中，分別加入20 mL甲醇，用水定容至刻度，其濃度分別為10，20，40，80，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，通過0.22 μm的濾膜過濾后上機(jī)檢測，以峰面積對樣品濃度進(jìn)行線性回歸。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5 g于25 mL的容量瓶中，依次加入0.8 mL 10%的亞鐵氰化鉀，加入0.8 mL 20%的乙酸鋅溶液，加入10 mL甲醇，最后用水定容至刻度，于離心機(jī)上轉(zhuǎn)速4000 r/min離心5 min,取清液過濾待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

用TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計在190～400 nm 波長下對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描。6種化學(xué)成分的最大吸收波長在210～250 nm之間，糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙酯的最大吸收波長依次為：210，215，220，230，225，245 nm，為盡可能兼顧所有目標(biāo)化合物的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選用230 nm為檢測波長。紫外-可見光譜圖見圖1。

圖1 紫外-可見光譜圖

2.2 流動相及流動相pH的選擇

實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇+甲酸銨緩沖溶液、甲醇+磷酸二氫銨、乙腈+甲酸銨緩沖溶液、甲醇+乙酸銨緩沖液、乙腈+乙酸銨緩沖溶液，結(jié)果顯示：以甲醇+乙酸銨緩沖液為流動相時，6種物質(zhì)分離效果最佳，靈敏度高，本實(shí)驗(yàn)采用乙酸來調(diào)節(jié)pH值，分別對pH 3.5，4.0，4.5，5.5，6.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：當(dāng)pH<4.5時，峰型有拖尾，其中1種物質(zhì)不能出峰，pH較高時出峰時間延時,有2種物質(zhì)不能完全分離(見圖2)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇流動相的酸度調(diào)節(jié)到4.5。

圖2 pH對被測物分離的影響

2.3 樣品提取溶劑的選擇

稱取一定量的樣品分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、水的提取效果，結(jié)果顯示：當(dāng)用水為提取液時，樣品與水互溶，上機(jī)檢測的色譜圖雜峰最多，分離困難；提取液為甲醇、乙醇、乙腈時，甲醇的分離效果最佳，靜置分層后清澈，上機(jī)檢測的色譜圖雜質(zhì)峰最少，無拖尾，分離度最高，因此選甲醇提取液較為理想。同時考察甲醇提取液的比例，用20%，40%，60%的甲醇溶液為提取液分別提取一定量的樣品，當(dāng)提取液為60%的甲醇溶液時，糖精鈉和安賽蜜峰型均有拖尾；用20%的甲醇溶液提取時，對羥基苯甲酸乙酯響應(yīng)值特別低，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用40%的甲醇溶液為提取溶劑。

2.4 流動相流速的選擇

流動相的流速主要對溶質(zhì)與固定相和流動相的相互作用有影響，從而改變待測組分的保留時間。流速太快，可能導(dǎo)致柱壓過高，引起漏液；流速太慢，會增加待測物的保留時間，容易引起色譜峰拖尾現(xiàn)象。所以實(shí)驗(yàn)過程中要選擇合適的流速，保持其他條件不變，改變流動相的流速為0.5，0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：流速低于0.6 mL/min時出峰時間延遲，有拖尾現(xiàn)象；流速超過1.2 mL/min時柱壓過高，出峰太快，分離效果不佳。綜合考慮樣品的分離度和分析時間，最終選定流速為1.0 mL/min,6種物質(zhì)能完全分離。

2.5 線性范圍與檢出限

在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程，見圖3。按信噪比(S/N)=3計算最低檢出限(LOD)，為0.15～0.23 mg/L，見表2。

圖3 6種被測物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

化合物線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2檢出限(mg/L)苯甲酸 y=16.202x+1.92060.99960.15安賽蜜 y=24.001x+3.83610.99980.17山梨酸y=18.728x-2.41240.99970.18脫氫乙酸 y=8.4849x+2.92890.99970.22對羥基苯甲酸乙酯y=11.82x+4.97530.99940.23糖精鈉 y=3.5805x+0.56190.99980.20

由圖3和表2可知，該方法對6種待測化合物具有較寬的線性范圍且具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)≥0.9994。

2.6 樣品檢測結(jié)果

按照上述樣品的制備方法分別處理醬油和食醋樣品，根據(jù)液相色譜分析條件檢測各個樣品溶液，測得峰面積，帶入回歸方程，計算得到樣品含量結(jié)果，見表3。結(jié)果表明：5種醬油中均檢測出添加防腐劑，2種添加甜味劑，5種食醋中檢測出3種添加防腐劑，圖4中a，b，c 分別為6種被檢測物質(zhì)、1種醬油和食醋的色譜圖。

表3 樣品檢測結(jié)果 g/L

注：ND為未檢出。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

2.7 加標(biāo)回收率與精密度

本實(shí)驗(yàn)采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對食醋樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加3個質(zhì)量濃度水平的標(biāo)樣溶液：10，40，80 μg/mL，按照以上設(shè)定的實(shí)驗(yàn)方法，分別測定其含量，不同濃度水平樣品進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計算出加標(biāo)回收率和精密度。

表4 6種被檢測物質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度

由表4可知，目標(biāo)化合物的平均回收率為97.24%～103.50%，RSD為1.45%～2.89%，結(jié)果表明：該方法的精密度和回收率都符合國內(nèi)外的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

3 結(jié)論

本文建立了采用高效液相色譜同時檢測醬油和食醋中6種添加劑的方法，各個待測組分均具有良好的分離度、精密度和準(zhǔn)確度，該方法操作簡單、快速且成本較低，符合相應(yīng)的檢測需求，適用于實(shí)驗(yàn)室中大批量樣品的檢測。