戴勝蘭 姚俊 許亞平

[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白是HBV核衣殼的組成部分，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細(xì)胞外釋放等過程，具有cccDNA調(diào)節(jié)功能并參與誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)。本文就HBV核心蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及在HBV治療中的研究進(jìn)展等方面，綜述了近年來靶向HBV核心蛋白治療慢性乙型肝炎的研究現(xiàn)狀，表明核心蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（CpAMs）可作為抗HBV藥物直接靶向HBV核心蛋白而干擾其活性，利用HBV核心蛋白為靶抗原誘導(dǎo)HBV特異性免疫反應(yīng)具有抗HBV及免疫調(diào)節(jié)作用，以期為慢性乙型肝炎的治療發(fā)展提供參考。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；核心蛋白；共價閉合環(huán)狀DNA；免疫反應(yīng)

[中圖分類號] R512.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0035-04

[Abstract] Hepatitis B virus （HBV） core protein is an integral part of HBV nucleocapsid， which is involved in viral packaging， viral maturation and viral releasing to the outside of cells. Core protein participates in regulation of cccDNA function and the induction of immune responses. This paper summarizes the research progress of targeting hepatitis B virus core protein in the treatment of chronic hepatitis B in recent years， starting from the structure and function of HBV core protein and the progress in the treatment of HBV. All of these indicate that core protein allosteric modulators （CpAMs） can directly interfere with the activity of HBV core protein as anti-HBV drugs， and the use of HBV core protein as a target antigen to induce HBV-specific immune responses has anti-HBV and immunomodulatory effects.These provide a theoretical reference for the development of treatment for chronic hepatitis B.

[Key words] Hepatitis B virus； Chronic hepatitis B； Core protein； Covalently closed circular DNA； Immune response

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有2.4億慢性HBV感染者，每年約有50萬人死于CHB相關(guān)的并發(fā)癥（如肝硬化和肝細(xì)胞癌等）[1]。當(dāng)前使用的抗病毒藥物主要為核苷（酸）類似物和干擾素-α，可以有效抑制HBV增殖，減緩乙型肝炎患者的發(fā)病進(jìn)程，但由于不能作用于共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），很難徹底清除病毒[2]。HBV核心蛋白是HBV核衣殼的組成部分，具有重要的生物學(xué)特性和功能，在T細(xì)胞和B細(xì)胞水平上，HBV核心蛋白的抗原性較乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HbeAg）強100倍，幾乎所有HBV感染者都產(chǎn)生HBV核心抗體（hepatitis B virus core antibody，HBcAb），同時存在T細(xì)胞免疫應(yīng)答，機體對核心蛋白的免疫應(yīng)答在清除HBV過程中具有重要作用[3]。因此HBV核心蛋白已成為抗HBV治療的重要而有前景的干預(yù)目標(biāo)。本文針對HBV核心蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及在HBV治療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 生物學(xué)特性

1.1 HBV核心蛋白的結(jié)構(gòu)特征

HBV核心蛋白由183個氨基酸殘基組成，分子量約21 kD。在HBV復(fù)制期間，信使RNA（mRNA）從HBV C基因的開放閱讀框架轉(zhuǎn)錄，翻譯從C基因的第二個密碼子AUG開始。起始的149個氨基酸殘基形成富含α螺旋的裝配結(jié)構(gòu)域，也被稱為球形的N末端（Nterminal domain，NTD），而末端的34個氨基酸殘基形成富含精氨酸的C端域（Cterminal domain，CTD）[4]。HBV核心蛋白構(gòu)成同型雙聚體，自行組裝為20面體的核殼。分為兩種類型：90個雙聚體形成三角形數(shù)為3（T=3）對稱，31 nm顆粒；120個雙聚體形成三角形數(shù)為4（T=4）對稱，35 nm顆粒。乙型肝炎患者體內(nèi)這兩種顆粒均存在，體積稍大的顆粒占多數(shù)[5]。

1.2 HBV核心蛋白與cccDNA的關(guān)系

HBV慢性感染的根源是cccDNA的存在，細(xì)胞外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，在乙肝病毒的復(fù)制過程中，病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核，在DNA聚合酶的作用下，形成cccDNA，cccDNA是HBV前基因組RNA復(fù)制的原始模板，雖然其含量較少，但對乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，只有清除了細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)，是抗病毒治療的目標(biāo)。然而，多年來用核苷類似物治療可以防止形成新的病毒粒子，但只是偶爾導(dǎo)致病毒的消失[6]。cccDNA與核心蛋白的相互作用知之甚少。從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的AD38細(xì)胞中分離的cccDNA鑒定核心蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其與核小體數(shù)目的變化相關(guān)[7]。染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immuno-precipitation，ChIP）顯示核心蛋白與CpG島優(yōu)先關(guān)聯(lián)[8]。CpG島2上核心蛋白的存在與cccDNA活性增加（即病毒載量）相關(guān)，而CpG島2和3中DNA的甲基化與cccDNA活性降低相關(guān)[8-9]。有研究推測驅(qū)動核心蛋白裝配的小分子[10]降低了游離核心蛋白的濃度，導(dǎo)致cccDNA結(jié)合核心蛋白的減少，使得病毒RNA及蛋白質(zhì)產(chǎn)量減少。E3泛素連接酶NIRF1被認(rèn)為是消耗cccDNA結(jié)合的核心蛋白的另一機制，也導(dǎo)致cccDNA活性抑制[11-12]。這些研究表明，HBV核心蛋白有助于表觀遺傳調(diào)控cccDNA，從而有利于延長cccDNA壽命。

干擾素α（IFN-α）被認(rèn)為可能在表觀遺傳學(xué)水平上可以清除HBV感染[13]，但僅在一部分患者中有效。在對免疫調(diào)節(jié)劑（IFN-α和淋巴毒素β受體抗體）作用機制的研究中，發(fā)現(xiàn)有證據(jù)表明胞苷脫氨酶APOBEC3A通過與cccDNA結(jié)合的核心蛋白直接相互作用被募集到cccDNA，使cccDNA容易被核酸酶降解[13]。這一發(fā)現(xiàn)提出了為什么HBV蛋白會招募病毒抑制蛋白的問題。核心蛋白也可以募集NIRF1來調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性和組蛋白修飾[11-12]。這些研究結(jié)果表明核心蛋白具有cccDNA調(diào)節(jié)功能。

1.3 HBV核心蛋白與機體免疫反應(yīng)

HBV核心蛋白參與IFN-α介導(dǎo)的cccDNA的破壞[13]。并且核心蛋白與干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）之間的相互作用也參與其中。在細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn)HBV核心蛋白抑制雙鏈DNA介導(dǎo)的IFN應(yīng)答。這種抑制的必要條件是核心蛋白的核位置可抑制ISG的轉(zhuǎn)錄[14]。核心蛋白也與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）相互作用，TRAIL與HBV感染的肝細(xì)胞死亡有關(guān)。核心蛋白的過度表達(dá)可減少TRAIL誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞凋亡，這與死亡受體5的表達(dá)減少有關(guān)[15]。

核心蛋白不僅作為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，還涉及HBV復(fù)制中的許多重要功能，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細(xì)胞外釋放等過程。核心蛋白也是B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫介導(dǎo)的病毒清除的目標(biāo)[16]。氮末端（N-terminal domain，NTD）NTD和碳末端（C-terminal domain，CTD）都可表達(dá)CTL和T細(xì)胞的表位，而B細(xì)胞表位主要在NTD上發(fā)現(xiàn)。這些表位的突變已顯示可影響機體免疫反應(yīng)[17-18]。在人類病例中，突變在CTL表位CTD的磷酸化位點與高級別肝纖維化相關(guān)[19]。核心蛋白通過與機體免疫因子相互作用，可調(diào)節(jié)病毒活性和肝細(xì)胞損傷，對核心蛋白的免疫應(yīng)答在病毒清除中可能具有重要意義。

2 靶向乙肝病毒核心蛋白在慢性乙型肝炎治療中的應(yīng)用

2.1 直接靶向HBV核心蛋白的抗病毒藥物

核心蛋白具有組裝惰性衣殼之外的活性，小分子可以通過作用于具體的核心蛋白構(gòu)象而差異地干擾每一種活性，這類小分子物質(zhì)被稱為核心蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（core protein allosteric modulators，CpAMs）。CpAMs的作用機制可分為3類：①形成異常裝配的核衣殼（而不是二十面體晶格）；②形成不能包裹前基因組RNA（pregenomicRNA，pgRNA）的“正常形狀”核衣殼，即空殼體；③干擾形成新的cccDNA。

雜芳基二氫嘧啶（HAPs）是被研究較多的一類通過第一種機制起作用的CpAMs。體外研究表明，HAPs在廣泛的濃度范圍內(nèi)促進(jìn)核心蛋白裝配成無功能衣殼聚合物[10，20]。不同的HAPs導(dǎo)致不同形式的衣殼聚合物[10]。除了影響殼裝配外，HAP在顯示病毒抑制活性時所需濃度遠(yuǎn)低于影響衣殼組裝所需要的濃度，這表明HAPs抗病毒活性的動力學(xué)效應(yīng)與異常衣殼結(jié)構(gòu)無關(guān)[21]，且在小鼠體內(nèi)研究中未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重毒性。

苯丙烯酰胺（PPAs）通過第二種機制起作用（即形成不能包裝pgRNA的空殼體）的另一類CpAMs。細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)這些化合物抑制HBV感染并可加速衣殼裝配[22]。PPAs存在時，衣殼組裝正常，仍然形成具有正常形態(tài)的二十面體核衣殼[23]。然而這些“正常的核衣殼”沒有包裹pgRNA，導(dǎo)致積累的空衣殼影響后續(xù)下游的病毒學(xué)復(fù)制。這些研究表明，PPAs的作用機制處于病毒衣殼和RNA包裝水平[24]。

HAP12是高濃度靶向裝配一類CpAMs，可以通過抑制cccDNA復(fù)制靶向cccDNA形成。研究表明，HAP12可弱結(jié)合核心蛋白變構(gòu)影響cccDNA[25]。作用于核心蛋白的裝配上游的這種變構(gòu)調(diào)節(jié)劑是否具有降低cccDNA活性和控制慢性感染的潛力尚需進(jìn)一步研究。

2.2 基于HBV核心蛋白的治療性疫苗

Maini等[26]研究發(fā)現(xiàn)在能夠抑制HBV復(fù)制及阻遏肝臟損傷的CHB患者體內(nèi)存在較高的HBc特異性CTL水平，研究證實了CHB患者體內(nèi)存在保護(hù)性的肝源性HBc特異性CTL和致病性抗原非特異性免疫。以上研究為應(yīng)用以核心蛋白為基礎(chǔ)的免疫干預(yù)治療CHB提供了理論基礎(chǔ)。Heathcote等[27]在20世紀(jì)90年代就以核心蛋白的表位為基礎(chǔ)治療CHB患者。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠含有HBV基因組和所有HBV相關(guān)抗原，可用來評估疫苗的效果。Akbar等[28]在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)評估以核心蛋白為基礎(chǔ)的細(xì)胞疫苗對肝內(nèi)免疫力的影響，研究發(fā)現(xiàn)，以核心蛋白為基礎(chǔ)的疫苗免疫后，血清中HBsAg轉(zhuǎn)陰并產(chǎn)生抗-HBs。此外，肝臟內(nèi)可檢測到HBs和HBc特異性CTL。另外，在HBV感染的鴨和土撥鼠模型中已經(jīng)顯示了HBV核心蛋白作為試驗性治療性疫苗的作用[29-30]。利用HBV核心蛋白為靶抗原誘導(dǎo)HBV特異性免疫反應(yīng)在治療慢性HBV感染方面具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)將HBV核心蛋白強制泛素化后，核心蛋白降解速度加快，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強，強制泛素化的核心蛋白體外可誘導(dǎo)DC成熟、刺激T淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生HBV特異性CTL反應(yīng)[31-33]，在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)HBc特異性CTL反應(yīng)，并可抑制HBV復(fù)制[34-35]。但目前可供人類應(yīng)用的HBV核心蛋白疫苗仍然需進(jìn)一步研究開發(fā)。

3 結(jié)語

近年來，對于HBV核心蛋白的結(jié)構(gòu)及功能已經(jīng)有了較深入的認(rèn)識，核心蛋白作為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細(xì)胞外釋放等過程，并與機體免疫反應(yīng)有關(guān)。靶向核心蛋白的治療包括CpAMs和治療性疫苗有望為抗HBV提供了新的治療策略，但目前仍然缺乏臨床研究來評價，有待進(jìn)一步的研究證實。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Schweitzer A，Horn J，Mikolajczyk RT，et al. Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection： a systematic review of data published between 1965 and 2013 [J]. Lancet，2015，386（10003）：1546-1555.

[2] Kwon H，Lok AS. Hepatitis B therapy [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8（5）：275-284.

[3] Tang TJ，De Man RA，Kusters JG，et al. Intrahepatic CD8 T-lymphocytes and HBV core expression in relation to response to antiviral therapy for chronic hepatitis B patients [J]. J Med Virol，2004，72（2）：215-222.

[4] Zlotnick A，Venkatakrishnan B，Tan Z，et al. Core protein：A pleiotropic keystone in the HBV lifecycle [J]. Antiviral Res，2015，121：82-93.

[5] Pairan A，Bruss V. Functional surfaces of the hepatitis B virus capsid [J]. J Virol，2009，83（22）：11 616-11 623.

[6] Gish RG，Lok AS，Chang TT，et al. Entecavir therapy for up to 96 weeks in patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B [J]. Gastroenterology，2007，133（5）：1437-1444.

[7] Bock CT，Schwinn S，Locarnini S，et al. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome [J]. J Mol Biol，2001，307（1）：183-196.

[8] Guo YH，Li YN，Zhao JR，et al. HBc binds to the CpG islands of HBV cccDNA and promotes an epigenetic permissive state [J]. Epigenetics，2011，6（6）：720-726.

[9] Zhang Y，Mao R，Yan R，et al. Transcription of hepatitis B virus covalently closed circular DNA is regulated by CpG methylation during chronic infection [J]. PLoS One，2014， 9（10）：e110 442.

[10] Bourne C，Lee S，Venkataiah B，et al. Small-molecule effectors of hepatitis B virus capsid assembly give insight into virus life cycle [J]. J Virol，2008，82（20）：10 262-10 270.

[11] Qian G，Hu B，Zhou D，et al. NIRF，a novel ubiquitin ligase，inhibits hepatitis B virus replication through effect on HBV Core protein and H3 histones [J]. DNA Cell Biol，2015，34（5）：327-332.

[12] Qian G，Jin F，Chang L，et al. NIRF，a novel ubiquitin ligase，interacts with hepatitis B virus core protein and promotes its degradation [J]. Biotechnol Lett，2012，34（1）：29-36.

[13] Lucifora J，Xia Y，Reisinger F，et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA [J]. Science，2014，343（6176）：1221-1228.

[14] Li L，Lei QS，Zhang SJ，et al. Suppression of USP18 potentiates the anti-HBV activity of interferon alpha in HepG2.2.15 cells via JAK/STAT signaling [J]. PLoS One，2016，11（5）：e0 156 496.

[15] Du J，Liang X，Liu Y，et al. Hepatitis B virus core protein inhibits TRAIL-induced apoptosis of hepatocytes by blocking DR5 expression [J]. Cell Death Differ，2009，16（2）：219-229.

[16] Pumpens P，Grens E. HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes [J]. Intervirology，2001，44（2-3）：98-114.

[17] Alexopoulou A，Baltayiannis G，Eroglu C，et al. Core mutations in patients with acute episodes of chronic HBV infection are associated with the emergence of new immune recognition sites and the development of high IgM anti-HBc index values [J]. J Med Virol，2009，81（1）：34-41.

[18] Khakoo SI，Ling R，Scott I，et al. Cytotoxic T lymphocyte responses and CTL epitope escape mutation in HBsAg，anti-HBe positive individuals [J]. Gut，2000，47（1）：137-143.

[19] Mohamadkhani A，Jazii FR，Poustchi H，et al. The role of mutations in core protein of hepatitis B virus in liver fibrosis [J]. Virol J，2009，6：209.

[20] Stray SJ，Bourne CR，Punna S，et al. A heteroaryldihydropyrimidine activates and can misdirect hepatitis B virus capsid assembly [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2005， 102（23）：8138-8143.

[21] Li L，Chirapu SR，F(xiàn)inn MG，et al. Phase diagrams map the properties of antiviral agents directed against hepatitis B virus core assembly [J]. Antimicrob Agents Chemother，2013，57（3）：1505-1508.

[22] Delaney WET，Edwards R，Colledge D，et al. Phenylpropenamide derivatives AT-61 and AT-130 inhibit replication of wild-type and lamivudine-resistant strains of hepatitis B virus in vitro [J]. Antimicrob Agents Chemother，2002，46（9）：3057-3060.

[23] Katen SP，Chirapu SR，F(xiàn)inn MG，et al. Trapping of hepatitis B virus capsid assembly intermediates by phenylpropenamide assembly accelerators [J]. ACS Chem Biol，2010，5（12）：1125-1136.

[24] Feld JJ，Colledge D，Sozzi V，et al. The phenylpropenamide derivative AT-130 blocks HBV replication at the level of viral RNA packaging [J]. Antiviral Res，2007，76（2）：168-177.

[25] Zhou Z，Hu T，Zhou X，et al. Heteroaryldihydropyrimidine （HAP） and Sulfamoylbenzamide （SBA） inhibit hepatitis B virus replication by different molecular mechanisms [J]. Sci Rep，2017，7：42 374.

[26] Maini MK，Boni C，Lee CK，et al. The role of virus-specific CD8（+） cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection [J]. J Exp Med，2000，191（8）：1269-1280.

[27] Heathcote J，Mchutchison J，Lee S，et al. A pilot study of the CY-1899 T-cell vaccine in subjects chronically infected with hepatitis B virus. The CY1899 T Cell Vaccine Study Group [J]. Hepatology，1999，30（2）：531-536.

[28] Akbar SM，Yoshida O，Chen S，et al. Immune modulator and antiviral potential of dendritic cells pulsed with both hepatitis B surface antigen and core antigen for treating chronic HBV infection [J]. Antivir Ther，2010，15（6）：887-895.

[29] Miller DS，Halpern M，Kotlarski I，et al. Vaccination of ducks with a whole-cell vaccine expressing duck hepatitis B virus core antigen elicits antiviral immune responses that enable rapid resolution of de novo infection [J]. Virology，2006，348（2）：297-308.

[30] Yin Y，Wu C，Song J，et al. DNA immunization with fusion of CTLA-4 to hepatitis B virus （HBV） core protein enhanced Th2 type responses and cleared HBV with an accelerated kinetic [J]. PLoS One，2011，6（7）：e22 524.

[31] Chen JH，Yu YS，Chen XH，et al. Enhancement of CTLs induced by DCs loaded with ubiquitinated hepatitis B virus core antigen [J]. World J Gastroenterol，2012，18（12）：1319-1327.

[32] Chen JH，Yu YS，Liu HH，et al. Ubiquitin conjugation of hepatitis B virus core antigen DNA vaccine leads to enhanced cell-mediated immune response in BALB/c mice [J]. Hepat Mon，2011，11（8）：620-628.

[33] 周麗芹，卓萌，陳小華，等.強制泛素化HBcAg融合基因重組慢病毒對小鼠體內(nèi)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2013，40（4）：217-221.

[34] Dai S，Zhuo M，Song L，et al. Dendritic cell-based vaccination with lentiviral vectors encoding ubiquitinated hepatitis B core antigen enhances hepatitis B virus-specific immune responses in vivo [J]. Acta Biochim Biophys Sin （Shanghai），2015，47（11）：870-879.

[35] Dai S，Zhuo M，Song L，et al. Lentiviral vector encoding ubiquitinated hepatitis B core antigen induces potent cellular immune responses and therapeutic immunity in HBV transgenic mice [J]. Immunobiology，2016，221（7）：813-821.