葉偉東，郭 成，曹海鵬，楊先樂

(1.上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫， 上海 201306； 2.上海海洋大學(xué) 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 3.水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306)

加州鱸(Micropterussalmonides)肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞，是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2016 年我國加州鱸養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到37萬多噸。然而，隨著養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，加州鱸養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，細(xì)菌性病害頻發(fā)，阻礙了加州鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。其中，出血病是加州鱸主要的細(xì)菌性病害之一，具有季節(jié)長，流行廣，發(fā)病率高，死亡率極高的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖戶造成了巨大損失[2]。目前，已有研究表明，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是草魚(Ctenopharyngodonidella)、鳊(Parabramispekinensis)、黃鱔(Monopterusalbus)等多種水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性出血病的病原菌[3-5]，也是加州鱸爛身病的病原菌[6]，但嗜水氣單胞菌引起加州鱸出血病鮮見詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從患出血病的加州鱸肝臟組織中分離到嗜水氣單胞菌LY4，通過人工回歸感染試驗(yàn)確定了其致病性，采用API 20E生理生化鑒定和16S rRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定，采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定了其耐藥性，并采用二倍稀釋法評(píng)價(jià)了35種中草藥水提取液對(duì)其產(chǎn)生的體外抑菌作用，進(jìn)一步豐富了加州鱸出血病的病原學(xué)研究資料，為加州鱸出血病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患病加州鱸，平均體重460 g，12尾，采集自上海某養(yǎng)殖場；健康加州鱸，平均體重62.8 g，購于上海青浦某養(yǎng)殖場；API 20E細(xì)菌生化鑒定試劑條，由法國梅里埃公司生產(chǎn)；藥敏紙片，購于杭州濱河微生物試劑有限公司；試驗(yàn)所用中草藥購自河北省安國市御顏坊中藥材有限公司。

1.2 病原菌的分離、純化與鑒定

1.2.1 病原菌的分離

無菌條件下取試驗(yàn)魚的肝、腎等組織，采用傳統(tǒng)方法[7]在營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行病原菌株的劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)一步純化，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后4 ℃冰箱保藏備用；與此同時(shí)，將純化的病原菌株接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，以確定病原菌株是否產(chǎn)生胞外蛋白酶[8]。

1.2.2 人工回歸感染試驗(yàn)

用無菌生理鹽水分別洗下營養(yǎng)瓊脂斜面上病原菌株的菌苔，用稀釋涂布平板法測(cè)定并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為5.0×103～5.0×107CFU/mL，然后參照安偉等[9]的方法對(duì)健康加州鱸進(jìn)行腹腔注射，每組魚注射15尾，每尾注射0.2 mL。對(duì)照組注射相同劑量的無菌生理鹽水，連續(xù)7 d觀察魚的發(fā)病及死亡情況，記錄死亡數(shù)目，并根據(jù)概率單位圖解法[10]測(cè)定病原菌株對(duì)加州鱸的半數(shù)致死劑量(LD50)。試驗(yàn)中及時(shí)檢查并撈出死魚，觀察病癥并進(jìn)行病原菌再分離，驗(yàn)證再分離菌株與原病原菌株的一致性。

1.2.3 病原菌的鑒定

參照徐輝等[11]的方法采用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定。同時(shí)，以病原菌株的基因組DNA為模板，對(duì)其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR的擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的純化與測(cè)序由上海杰李生物科技有限公司完成。將測(cè)得序列用DNAMAN軟件編輯后，在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中利用BLASTN軟件與GenBank基因庫中已知的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取同源性較高的序列并利用軟件Mega 5.0進(jìn)行多重比較后通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 病原菌對(duì)抗生素的耐藥性檢測(cè)

參照KB紙片擴(kuò)散法[12]進(jìn)行，即以涂布法接種致病菌株，然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑(mm)，根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司提供的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》，確定病原菌株對(duì)抗生素的耐藥性。

1.4 中草藥對(duì)病原菌最小抑菌濃度的測(cè)定

采用二倍稀釋法[13]測(cè)定35種中草藥(表1)水提取液對(duì)病原菌株的最小抑菌濃度(MIC)。即取含有2 mL無菌營養(yǎng)肉湯的試管14支并編號(hào)，于第1管中加入2 mL中草藥水提取液(終質(zhì)量濃度為1 000 mg/mL)至終質(zhì)量濃度為500 mg/mL，混勻后再取2 mL加入第2管中至終質(zhì)量濃度為250 mg/mL，依次倍比稀釋直至第13管(其中2 mL棄用)，分別至終質(zhì)量濃度為125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.97、0.49、0.24、0.12 mg/mL，第14管為陽性對(duì)照，不加中草藥水提取液，然后分別接種病原菌株至終濃度5.0×105CFU/mL，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以相同培養(yǎng)條件的空白無菌營養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照。把無菌生長、稀釋度最大的中草藥水提取液質(zhì)量濃度作為病原菌株的最小抑菌濃度。其中，中草藥水提取液的制備參照張顯忠等[14]的方法，即將35種中草藥分別稱取100 g，加1～2 L蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，用4層紗布過濾取藥液，藥渣再加蒸餾水0.5～1 L，重復(fù)以上操作取藥液。合并兩次藥液，用文火濃縮至100 mL，即制成終質(zhì)量濃度為1 000 mg/mL的中草藥水提取液。

表1 試驗(yàn)用中草藥名錄Tab.1 Tested Chinese herbs

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離與致病性

從患病加州鱸肝臟組織中分離到1株病原菌(LY4)，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板形成的菌落周圍具有清晰、透明的溶蛋白圈，說明能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶。人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，菌株LY4對(duì)健康加州鱸具有致病性，回歸感染發(fā)病的加州鱸也出現(xiàn)體表出血、充血等與自然發(fā)病魚相同的病癥，而且從回歸感染致死的魚體內(nèi)又可分離到與原菌株一致的菌株，表明菌株LY4是加州鱸出血病的病原菌。根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率(Y)與菌液濃度對(duì)數(shù)(X)的關(guān)系曲線方程：Y= 0.984X-0.659 5，菌株LY4對(duì)健康加州鱸的LD50為5.7×105CFU/mL。

表2 菌株LY4對(duì)加州鱸的人工回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Artificial infection of strain LY4 to healthy M.salmoides

2.2 病原菌的鑒定

API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株LY4的生理生化鑒定結(jié)果表明(表3)，菌株LY4為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，可信度為99.9%。此外，通過對(duì)菌株LY4的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1 400 bp大小的片段，其在GenBank上的序列號(hào)為：KY694995?；诰闘Y4 16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)進(jìn)一步表明，菌株LY4與嗜水氣單胞菌ATCC 49140(GenBank序列號(hào)：AY987754)的親緣關(guān)系最近。綜合生理生化特性鑒定與16S rRNA基因序列分析的結(jié)果，最終判定菌株LY4為嗜水氣單胞菌。

表3 菌株LY4的生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性；“d”表示種間存在差異

圖1 基于菌株LY4 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain LY4 括號(hào)中的序號(hào)代表菌株的GenBank登錄號(hào);分支點(diǎn)上的數(shù)字代表計(jì)算1000次聚類到一起的幾率;標(biāo)尺刻度代表0.05%的序列差異

2.3 病原菌的耐藥性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，菌株LY4對(duì)青霉素、阿莫西林、甲氧嘧啶、四環(huán)素、多西環(huán)素、呋喃唑酮等6種抗生素耐藥，對(duì)紅霉素、卡那霉素等2種抗生素中等敏感，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟等9種抗生素高度敏感。

表4 菌株LY4的藥敏特性Tab.4 Antibiotic susceptibility of strain LY4

注：“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示耐藥

2.4 中草藥對(duì)病原菌的最小抑菌濃度

由表5可知，五倍子、烏梅、地榆等3種中草藥水提取液對(duì)菌株LY4具有良好的抑菌作用。具體表現(xiàn)在：五倍子水提取液、烏梅水提取液、地榆水提取液對(duì)菌株LY4的MIC分別為7.81、15.63和15.63 mg/mL，而赤芍水提取液對(duì)菌株LY4的MIC為31.25 mg/mL，石榴皮、山楂、熟地黃等中草藥水提取液對(duì)菌株LY4的MIC均為62.5 mg/mL，其他28種中草藥的水提取液對(duì)菌株LY4的MIC均不低于125 mg/mL。

表5 中草藥水提取液對(duì)菌株LY4的最小抑菌濃度Tab.5 MICs of water extracts from Chinese herbs against strain LY4 mg/mL

續(xù)表5

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌的鑒定

一般來說，嗜水氣單胞菌菌株不同，其理化特性也具有差異。李圓圓等[16]分離的鱘源嗜水氣單胞菌與張曉君等[17]分離的草魚源嗜水氣單胞菌就表現(xiàn)出不同的鼠李糖發(fā)酵特性。因此，嗜水氣單胞菌的鑒定方法通常是在生理生化鑒定的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行16S rRNA基因序列分析鑒定[18]。本實(shí)驗(yàn)綜合生理生化鑒定與16S rRNA 基因序列分析，判定菌株LY4為嗜水氣單胞菌，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株LY4與樊海平等[7]分離的鰻源嗜水氣單胞菌JS70322NA、張友平等[15]分離的蝦源嗜水氣單胞菌MrM0602在利用檸檬酸鈉特性方面也存在差異，可能與地區(qū)、氣候、水質(zhì)條件及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等方面的不同有關(guān)[19]。

3.2 嗜水氣單胞菌的毒力與致病性

嗜水氣單胞菌的不同菌株間通常存在著毒力差異。王玉娟等[20]從患病革胡子鯰分離的嗜水氣單胞菌1403的LD50為6.32 ×106CFU/mL，張慶華等[21]從患病金錢魚分離的嗜水氣單胞菌Ah201416的LD50為7.35×107CFU/mL。本實(shí)驗(yàn)分離的嗜水氣單胞菌LY4的LD50為5.7×105CFU/mL，其毒力高于嗜水氣單胞菌1403、嗜水氣單胞菌Ah201416，可能與嗜水氣單胞菌的不同菌株攜帶的毒力基因的種類和數(shù)量不同有關(guān)[22]。

胞外蛋白酶是嗜水氣單胞菌的重要致病因子，主要由具有較強(qiáng)致病性的絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶等多種蛋白酶組成[15]。儲(chǔ)衛(wèi)華等[23]研究表明，嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶能夠引起魚體出現(xiàn)出血、充血等病癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌LY4具有胞外蛋白酶活性，而且回歸感染的魚體也具有出血、充血等病癥。因此，嗜水氣單胞菌LY4對(duì)加州鱸產(chǎn)生的致病性與胞外蛋白酶的產(chǎn)生密切相關(guān)。

3.3 嗜水氣單胞菌的耐藥性及其中草藥控制

不同分離源的嗜水氣單胞菌對(duì)抗生素的耐藥性往往存在差異。夏飛等[24]分離的團(tuán)頭魴致病性嗜水氣單胞菌對(duì)青霉素、阿莫西林、四環(huán)素耐藥；鄧國成等[3]分離的草魚致病性嗜水氣單胞菌對(duì)青霉素、阿莫西林也耐藥，但對(duì)四環(huán)素卻高度敏感。本實(shí)驗(yàn)分離的嗜水氣單胞菌LY4除了對(duì)青霉素、阿莫西林、四環(huán)素耐藥外，對(duì)多西環(huán)素這一水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用的抗生素也產(chǎn)生了耐藥性。出現(xiàn)這些耐藥性差異的原因可能是由于不同養(yǎng)殖地區(qū)、不同養(yǎng)殖環(huán)境中的菌株因接觸不同的藥物環(huán)境而產(chǎn)生耐藥性變異[25]。

中草藥因其來源廣泛、安全性高、毒副作用小、抗耐藥機(jī)制多樣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為解決病原菌耐藥性的新途徑[26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五倍子、烏梅、地榆等中草藥水提取液對(duì)嗜水氣單胞菌LY4具有良好的抑菌效果，這與羅新等[27]、彭金菊等[28]、陳霞等[29]的研究觀點(diǎn)相同。究其原因，可能與五倍子和地榆含有鞣質(zhì)、烏梅含有有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)有關(guān)[30-32]。然而，本實(shí)驗(yàn)中五倍子、烏梅等中草藥水提取液對(duì)嗜水氣單胞菌LY4的MIC分別為7.81 mg/mL和15.63 mg/mL，而羅新等[27]、彭金菊等[28]實(shí)驗(yàn)表明烏梅水提取液和五倍子水提取液對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC分別為1 000 mg/mL和1.563 mg/mL，表現(xiàn)出抑菌效果的差異性，可能與菌株差異、中草藥的采集地、采摘季節(jié)、煎煮方法等條件有關(guān)[33]。因此，在使用中草藥控制加州鱸出血病嗜水氣單胞菌時(shí)，應(yīng)把握用藥量，注意選擇加工方法[34]。