羅鳴鐘，楊曼綺，郭 坤，阮國良，楊代勤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025)

黃鱔(Monopterusalbus)俗稱鱔魚，是我國重要的名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。其含肉率高達(dá)70%，肌肉中蛋白質(zhì)含量達(dá)18.8%,而脂肪含量低于1%[1]，具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受我國和東南亞人民的喜愛。目前，我國以及日本、朝鮮、越南等東南亞國家均開展了黃鱔的集約化養(yǎng)殖[2]。而湖北省作為我國黃鱔養(yǎng)殖的第一省，鱔魚產(chǎn)量占全國的50%以上。2015年湖北省黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)到17.21萬噸，產(chǎn)值超百億元，湖北省水產(chǎn)局已將黃鱔養(yǎng)殖業(yè)作為3個“百億元”的名優(yōu)水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)之一，在“十三五”進(jìn)行優(yōu)先發(fā)展和重點(diǎn)扶持打造[3]。目前，黃鱔養(yǎng)殖主要以基于池塘的網(wǎng)箱養(yǎng)殖為主。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，有機(jī)磷農(nóng)藥的大量使用造成水域生態(tài)環(huán)境污染，野生鱔苗種自然資源量急劇減少，苗種短缺已成為制約黃鱔養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸[4]。

有機(jī)磷農(nóng)藥是有機(jī)磷酸脂類農(nóng)藥的簡稱，具有高效、快速、廣譜性的特點(diǎn)，常被作為高效殺蟲劑和植物生長調(diào)節(jié)劑而廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，是世界上生產(chǎn)和使用最多的農(nóng)藥品種之一。有機(jī)磷能抑制膽堿脂酶活性，引起乙酰膽堿代謝紊亂，其代謝產(chǎn)物能抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，引起一系列神經(jīng)綜合癥，對水生動物具有很強(qiáng)的急性毒性[5]。研究表明，在農(nóng)藥施用過程中，僅有1%左右作用于靶生物，其余的或殘留于土壤，或通過間接途徑進(jìn)入水環(huán)境[6]。水體是有機(jī)磷的主要?dú)w宿，農(nóng)業(yè)、漁業(yè)活動使用的有機(jī)磷農(nóng)藥最終會匯入水環(huán)境中，對微生物、水生動物產(chǎn)生較大的危害。有機(jī)磷農(nóng)藥對同種魚類的不同組織和不同魚類的同種組織中乙酰膽堿脂酶的抑制程度不同[7]，因此，有機(jī)磷農(nóng)藥對魚類的毒性存在種間差異。目前，關(guān)于常見的有機(jī)磷農(nóng)藥如：氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲等對黃鱔的急性毒性尚未見報道。

長江大學(xué)黃鱔研究團(tuán)隊從事黃鱔基礎(chǔ)及應(yīng)用研究近20年，于2013年取得突破，摸索出稻田網(wǎng)箱仿生態(tài)黃鱔繁殖技術(shù)，獲得黃鱔苗種超過百萬尾[8]。了解稻田常用農(nóng)藥對黃鱔幼魚的毒性效應(yīng)，對于完善和推廣稻田網(wǎng)箱仿生態(tài)黃鱔繁殖技術(shù)具有重要的實(shí)踐意義。本研究以黃鱔幼魚為研究對象，采用半靜態(tài)方式水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法，研究農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的有機(jī)磷農(nóng)藥：氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲對其的急性毒性效應(yīng)，得出半數(shù)致死濃度、安全濃度以及藥物毒性蓄積程度系數(shù)，為黃鱔野生資源的保護(hù)以及苗種的人工繁育技術(shù)提供理論依據(jù)，并為池塘養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險評估與管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為長江大學(xué)黃鱔研究所繁育的黃鱔幼魚，體質(zhì)量(0.03±0.01)g，體長(3.71±0.27)cm，挑選外觀正常，體質(zhì)健康，規(guī)格接近的個體用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室，用水為曝氣的自來水，氣泵連續(xù)充氣，溫度為(27.0±1.5)℃，pH為7.5 ～8.0，溶氧 ≥ 6.0 mg/L。

氧樂果由河北軍星生物化工有限公司生產(chǎn)，有效成分 40%；乙酰甲胺磷由湖北沙隆達(dá)股份有限公司生產(chǎn)，有效成分30%；馬拉硫磷由遼寧葫蘆島凌云農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)，有效成分45%；敵百蟲由江蘇綠野農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，有效成分90%。按4種農(nóng)藥的有效濃度配置試驗(yàn)液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選擇5個間距較大的試液濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察幼魚在24 h內(nèi)的情況，得出幼魚的最大無死亡質(zhì)量濃度和全部致死濃度。依照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的藥品濃度梯度。

實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)方式水生生物急性毒性實(shí)驗(yàn)法[9]。實(shí)驗(yàn)期間不投餌，為保證實(shí)驗(yàn)藥液質(zhì)量濃度，每隔 24 h 更換藥液1 次。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果按等對數(shù)間距設(shè)計6個質(zhì)量濃度梯度，見表1。每濃度組10尾幼魚，設(shè)3個平行組，1個空白對照組。實(shí)驗(yàn)開始后6 h連續(xù)觀察幼魚的反應(yīng)情況并記錄，以后在24、48、72、96 h觀察，記錄死亡數(shù)據(jù)并及時清出死亡個體。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為：目測無可視動作發(fā)生 (如鰓蓋運(yùn)動)、 碰觸尾柄后無反應(yīng)，即可判斷該魚死亡。

表1 4種有機(jī)磷農(nóng)藥的實(shí)驗(yàn)濃度Tab.1 The concentrations of four organophosphorus pesticides /(mg/L)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用寇式法(Karber)計算半致死濃度(LC50)、安全濃度(SC)和半致死濃度的95%置信區(qū)間(CI)，并做實(shí)驗(yàn)濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)與死亡率為縱坐標(biāo)的直線回歸方程[9]，利用藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC)來分析黃鱔體內(nèi)對有機(jī)磷農(nóng)藥的蓄積、降減變化[10]，相關(guān)計算公式如下：

半致死濃度(LC50，mg/L)：Log LC50=Xm-d(∑p-0.5)

安全濃度(SC，mg/L)：SC=48 h LC50× 0.3 / (24 h LC50/48 h LC50)2

半致死濃度95%置信區(qū)間(CI，mg/L)：95% CI=Log LC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC，%)：MAC=100% ×(t1LC50-t2LC50)/(t0LC50-tmLC50)

上式中：Xm為有機(jī)磷農(nóng)藥最大濃度的對數(shù)，d為相鄰濃度的對數(shù)差值，p為死亡率(%)，為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組實(shí)驗(yàn)魚尾數(shù)；t1LC50和t2LC50為觀察時段t1和t2的半致死濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為實(shí)驗(yàn)初始、結(jié)束時半致死濃度(mg/L)。

2 結(jié)果

2.1 中毒癥狀

實(shí)驗(yàn)初期，4種農(nóng)藥低濃度組(濃度Ⅰ和Ⅱ)的黃鱔幼魚均集中于燒杯底部，靜止不動或偶爾游動。4 h后，4種藥液的中高濃度組(濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的幼鱔活動逐漸變得頻繁而急躁，表現(xiàn)為部分在水底急游后便向水面竄，接著緩慢下沉。6 h后，乙酰甲胺磷和敵百蟲藥液的中高濃度組便有幼鱔直立在水中，頭部探向水面。隨著時間的延長，4種藥液高濃度組的幼魚先后開始在底部低頻率的輕微抽搐，時而游竄到水面后便很快無力下沉。8 h后，4種藥液的高濃度組中部分幼鱔開始持續(xù)性地劇烈抽搐，身體扭曲且緊繃痙攣，體色由黑色變?yōu)闇\灰且略透明，暗紅色的血管和心臟清晰可見，表現(xiàn)為血管收縮、膨大的心臟在激烈的搏動。同時幼鱔在應(yīng)激過程中粘液分泌量增多，馬拉硫磷藥液中的幼魚應(yīng)激持續(xù)時間較其他三種更長。

2.2 4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的急性致死效應(yīng)

表2顯示，在96 h的毒性實(shí)驗(yàn)中對照組均未發(fā)生死亡，各濃度處理組幼鱔的死亡率均隨藥物濃度增加、實(shí)驗(yàn)時間延長而上升。低濃度的氧樂果和敵百蟲對幼鱔急性致死效應(yīng)較小，96 h的死亡率均低于10%。四種有機(jī)磷農(nóng)藥最高實(shí)驗(yàn)濃度對幼鱔急性致死效應(yīng)較大，除24 h時的馬拉硫磷，其余時間各組均表現(xiàn)出100 %的死亡率。各農(nóng)藥的空白對照組均無死亡現(xiàn)象。

表2 4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的致死率Tab.2 Death rates of four organophosphorus pesticides to juvenile M.albus

續(xù)表2

2.3 4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的毒性效應(yīng)

根據(jù)相關(guān)計算公式[10-11]得出氧樂果、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷和敵百蟲對黃鱔幼魚的半致死濃度LC50、半致死濃度的95%置信區(qū)間CI、藥物毒性蓄積程度系數(shù)MAC和安全濃度SC(表3)。半致死濃度均隨實(shí)驗(yàn)時間的延長而下降，氧樂果對幼鱔24、48、72、96 h的半致死濃度分別為6.190、4.460、3.042、1.761 mg/L，乙酰甲胺磷為67.350、60.954、55.804、51.286 mg/L，馬拉硫磷為5.058、3.981、3.404、2.992 mg/L，敵百蟲為13.622、6.993、3.303、2.308 mg/L。安全濃度由低到高為：敵百蟲0.553 mg/L，氧樂果0.695 mg/L，馬拉硫磷0.740 mg/L，乙酰甲胺磷14.978 mg/L。四種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的藥物毒性蓄積程度系數(shù)均隨實(shí)驗(yàn)時間的延長而下降，氧樂果和馬拉硫磷的MAC下降較慢，而乙酰甲胺磷和敵百蟲下降較快。

根據(jù)藥物濃度對數(shù)和死亡率—概率單位的關(guān)系計算出 4 種藥物 24 h、48 h 和 96 h 的回歸方程如表 4 所示。

表3 4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的急性毒性特征分析Tab.3 Analysis of acute toxicity of four organophosphorus pesticides on juvenile M.albus

續(xù)表3

表4 4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚的回歸方程Tab.4 Regression equations of four organophosphorus pesticides for juvenile M.albus

注：*表示差異顯著(F0.05F0.01)。

3 討論

3.1 4種農(nóng)藥對黃鱔幼魚的急性毒性比較

農(nóng)藥對魚類的急性毒性的強(qiáng)弱一般用半致死濃度(LC50)來衡量，且呈負(fù)相關(guān)，即LC50值越小，農(nóng)藥的毒性越強(qiáng)；LC50值越大，毒性越弱[12]。本研究得出了4種有機(jī)磷農(nóng)藥對黃鱔幼魚 24、48、72、96 h 的LC50值，但一般較多采用 96 h LC50來確定藥物對水生動物的急性毒性大小。根據(jù)國家環(huán)保總局發(fā)布的毒性分類標(biāo)準(zhǔn)[13]，急性毒性96 h LC50<0.1 mg /L為劇毒，0.1～1.0 mg /L為高毒，1.0～10.0 mg /L為中毒，>10.0 mg /L為低毒。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙酰甲胺磷對黃鱔幼魚的96 h LC50為51.286 mg/L，屬低毒，氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲的96 h LC50分別為1.761 mg/L、2.992 mg/L和2.308 mg/L，均屬中毒。4種農(nóng)藥對黃鱔幼魚的毒性大小為：氧樂果>敵百蟲>馬拉硫磷>乙酰甲胺磷。本結(jié)果也表明，相對于氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等有機(jī)磷農(nóng)藥，乙酰甲胺磷對黃鱔的毒性較小，在黃鱔養(yǎng)殖周邊的稻田應(yīng)盡量選擇乙酰甲胺磷，而必須嚴(yán)格控制氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等有機(jī)磷農(nóng)藥的使用量以及廢藥處理。

本實(shí)驗(yàn)中所用4種藥物均屬于有機(jī)磷農(nóng)藥，但對黃鱔幼魚的毒性存在差異。有機(jī)磷農(nóng)藥對水生動物致毒作用機(jī)理主要是抑制乙酰膽堿脂酶活性，造成乙酰膽堿的大量蓄積而不能水解，致使后續(xù)神經(jīng)元或效應(yīng)器持續(xù)興奮，引起痙攣麻痹等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。當(dāng)組織中膽堿脂酶抑制達(dá)40%～60%時，動物可在幾秒鐘內(nèi)死亡[14]。一般認(rèn)為毒性差異的主要原因是有機(jī)磷農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)差異所造成，對膽堿酯酶分子親和力越強(qiáng)，毒性越大[15-16]。本實(shí)驗(yàn)也表明農(nóng)藥的物理特性如水溶性也與其毒性有一定關(guān)系，水溶性可促進(jìn)毒性増強(qiáng)，如氧樂果水溶性高達(dá)39 800 mg/L[17]。

3.2 4種農(nóng)藥在黃鱔幼魚體內(nèi)的蓄積與降減的特征分析

MAC即藥物毒性蓄積程度系數(shù)，常作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數(shù)，來分析生物體對藥物的蓄積與降減動態(tài)[18]。MAC值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；MAC>0 時，蓄積作用強(qiáng)度大于降減作用，反之亦然。

據(jù)表3可知，4種有機(jī)磷農(nóng)藥的MAC值均在24～48 h間出現(xiàn)最大值且均大于0，表明此時間段內(nèi)毒性在幼鱔體內(nèi)蓄積的作用頗強(qiáng)，蓄積作用強(qiáng)度遠(yuǎn)大于降減作用，即為其死亡高峰時段；而后MAC值隨著時間的延長而下降，表明幼鱔對有機(jī)磷農(nóng)藥毒性的抵抗能力逐漸上升，毒效漸漸消減。通過比較4種有機(jī)磷農(nóng)藥的MAC值，發(fā)現(xiàn)幼鱔對氧樂果和乙酰甲胺磷在各實(shí)驗(yàn)時間段蓄積幅度較為均衡，說明其毒效蓄積較強(qiáng)，降解毒效能力較差；在實(shí)驗(yàn)48～96 h幼鱔對馬拉硫磷和敵百蟲的MAC值下降明顯，馬拉硫磷實(shí)驗(yàn)72～96 h的MAC值是24～48 h的38.22%，敵百蟲實(shí)驗(yàn)72～96 h的MAC值是24～48 h的15.01%，說明其降解毒效能力較強(qiáng)，毒效蓄積速度下降，敵百蟲實(shí)驗(yàn)尤為明顯。故在探討農(nóng)藥對生物的毒性效應(yīng)時，應(yīng)分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效對其的影響。

3.3 4種農(nóng)藥對黃鱔幼魚的安全性評價

黃鱔人工苗種數(shù)量緊缺已成為我國黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，如何提高黃鱔苗種繁育的規(guī)模和選育出黃鱔良種，是當(dāng)前黃鱔研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。長江大學(xué)黃鱔研究團(tuán)隊雖然研發(fā)出了黃鱔稻田網(wǎng)箱仿生態(tài)繁育技術(shù)，可人工繁育生產(chǎn)黃鱔苗種，但此項技術(shù)仍不成熟，且受環(huán)境條件影響大，難以實(shí)現(xiàn)高效的規(guī)模繁育生產(chǎn)。稻田作為黃鱔生態(tài)繁育的主要場所，其土壤和水體環(huán)境對其繁殖效果產(chǎn)生重要影響。本研究采用急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)果表明氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲對黃鱔幼魚屬中毒，乙酰甲胺磷為低毒。但部分有機(jī)磷農(nóng)藥可通過對環(huán)境的吸附、移動以及生物富集等作用，長期存在于大氣、土壤(沉積物)和水體環(huán)境中[19-20]。有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入環(huán)境后對靶標(biāo)和非靶標(biāo)生物群落均會產(chǎn)生影響，其對黃鱔的慢性毒性如何，尚需進(jìn)一步研究。同時，應(yīng)考慮水溫、pH、溶解氧、有機(jī)物、各種水生生物等諸多因子的影響，如敵百蟲在堿性環(huán)境下會轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的敵敵畏[21]。

基于本研究結(jié)果，建議在進(jìn)行黃鱔稻田繁育和養(yǎng)殖前，應(yīng)檢測土壤和水體中的有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留情況。同時應(yīng)嚴(yán)格控制周邊稻田中氧樂果、馬拉硫磷和敵百蟲等中高毒農(nóng)藥的使用以及廢藥的處理，在使用過程中需密切觀察黃鱔的活動情況。