鞠守勇，李金山

(1.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，武漢 430074； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

近年來，我國漁業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量不斷增加，原有的粗放型養(yǎng)殖模式逐漸被集約化的養(yǎng)殖模式代替，單位面積產(chǎn)量增加迅速[1]。養(yǎng)殖過程中殘餌量、動(dòng)物殘骸和和魚體排泄物逐漸增加，水體中大量滋生有害細(xì)菌、病毒等致病微生物，大大增加養(yǎng)殖魚類患病機(jī)率，甚至導(dǎo)致魚類死亡。為了預(yù)防魚病的發(fā)生，在大規(guī)模高密度養(yǎng)殖的過程中，往往在飼料中添加抗生素或者在養(yǎng)殖過程中使用一些化學(xué)漁藥以預(yù)防魚病的爆發(fā)。但飼料中長期添加抗生素或長時(shí)間濫用化學(xué)藥物容易引發(fā)病原菌耐藥性，同時(shí)也使抗生素或化學(xué)藥物殘留在魚體內(nèi)，造成魚產(chǎn)品質(zhì)量不合格，引發(fā)食品安全問題[2-3]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬[4]，其肉質(zhì)鮮美，生長迅速，飼料來源廣，是我國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有舉足輕重的地位[1]。近幾年，隨著草魚大規(guī)模高密度養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，草魚病害問題已嚴(yán)重阻礙了草魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-3]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)是當(dāng)前研究比較清楚的一種益生菌，也是被我國農(nóng)業(yè)部認(rèn)可的安全的飼料添加劑，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，研究表明飼料中添加一定比例的枯草芽孢芽菌能有效促進(jìn)各種魚類生長、提高其免疫及抗病能力[2-3]。本研究分離到一株枯草芽孢桿菌，并探討飼料中添加該菌株后對草魚腸道消化酶的影響，以及對草魚增重率及相對生長速度的影響，為將該菌株開發(fā)成為漁用微生態(tài)制劑產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

WTC019菌株分離于湖北省武漢市秸稈堆土壤中，發(fā)酵培養(yǎng)至芽孢期用于本研究。LB培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10 g/L，酵母浸出液5 g/L，NaCl 10 g/L， pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌處理30 min。固態(tài)培養(yǎng)基：液態(tài)培養(yǎng)基中添加2%瓊脂，121 ℃滅菌處理30 min。

試驗(yàn)用草魚購買自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的草魚約480尾，隨機(jī)分成4組，其中A組為基礎(chǔ)飼料對照組，B、C、D組為試驗(yàn)組，在飼料加工過程中，分別添加WTC019至芽孢數(shù)目為1×106CFU/g(B組)、1×107CFU/g(C組)、1×108CFU/g(D組)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾草魚。每組設(shè)3個(gè)平行，共12個(gè)水族箱(高60 cm，直徑80 cm)，每個(gè)水族箱放養(yǎng)40 尾草魚，個(gè)體初始重量(146.23±14.56)g。

1.2 菌株分離方法

稱取少量的秸稈堆下方土壤放入含有醋酸鉀終濃度為0.3 mol/L的50 mL LB液體培養(yǎng)基，震蕩充分混勻，75 ℃處理10 min，離心取上清液，稀釋到10-6涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)，24 h復(fù)紅染色觀察營養(yǎng)體，培養(yǎng)60 h染色用油鏡觀察芽孢情況。

1.3 菌株鑒定

按照文獻(xiàn)[5]方法，用枯草芽孢芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn (ATCC?23857TM，168)做對照對WTC019菌株進(jìn)行生理生化鑒定；用WTC019菌株的基因組DNA為模板，引物為27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGYTACCTTGTTACGACT)擴(kuò)增16S rRNA基因并測序，用 MEGA軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹[6]。

1.4 試驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)飼料的組成和主要營養(yǎng)水平見表 1。 基礎(chǔ)飼料原料經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎后過60 目篩，根據(jù)草魚配合飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T1024-1997)配制基礎(chǔ)飼料，原料按照由少到多的比例分步用混合機(jī)充分混合均勻后，然后添加蒸餾水300 g/kg，混合均勻后加工成直徑2.0 mm左右的顆粒飼料，無菌室晾干，-20 ℃保存?zhèn)溆肹4]。

表1 基礎(chǔ)飼料組成和營養(yǎng)成分( 風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet ( air-dry basis) %

注：預(yù)混料為每千克飼料提供：維生素A 150 000 IU，維生素D 330 000 IU，維生素E 750 mg，維生素B 2 000 mg，維生素K 3 150 mg，鐵 2.5 g，銅 0.075 g，鋅 0.75 g，錳 0.5 g，鎂 5 g，碘22.5 mg，硒 3.5 mg，鈷7.5 mg。

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于室內(nèi)配備有微流水和充氧設(shè)備的養(yǎng)殖系統(tǒng)(高60 cm，直徑80 cm)中，用基礎(chǔ)飼料馴食1周，每日按照魚體重的3%～5%，在8：30 和 16：30 各投喂一次，1 h 后撈取殘餌，定期換水30%并去除糞便，水溫(25±3)℃，保持溶氧6～8 mg/L，試驗(yàn)周期60 d。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 生長性能的測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)分別對各池的草魚進(jìn)行記數(shù)、稱重，并計(jì)算增重率、特定生長率和存活率。

增重率(WGR)= (mt-m0)/m0×100%；

特定生長率(SGR)= (lnmt-lnm0)/d×100%；

存活率(SR)=nt/n0×100%。

公式中mt為終體重(g)，m0為初體重(g)，d為養(yǎng)殖天數(shù)(d)，nt為終末尾數(shù)，n0為初始尾數(shù)。

1.6.2 消化酶及抗氧化指標(biāo)的測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，所有試驗(yàn)草魚饑餓24 h，每組隨機(jī)撈取10尾麻醉，用無菌注射器尾靜脈采血，隨后放入4 ℃冰箱，靜置12 h，4 ℃條件下4 000 r/min 離心15 min，取上層血清分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱保存，備測過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽。采血完畢的草魚，在冰塊上解剖，剪開前腸段，清洗消化道，用無菌水充分沖洗外表，無菌解剖刀刮取腸內(nèi)容物，取腸道中間層內(nèi)容物，放入無菌離心管中，保存于-80 ℃冰箱，備測消化酶活性。過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽均使用試劑盒測定，按照試劑盒中的說明書操作。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)

用 SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素One-way ANOVA方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( Mean±SD)表示，顯著水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征

采用1.2方法，從湖北省武漢市秸稈堆土壤中得到一株細(xì)菌WTC019，37 ℃培養(yǎng)3 d后，其菌落不透明，白色近圓形，微隆起，邊緣葉狀齒狀；挑取少量培養(yǎng)12 h的菌體復(fù)紅染色，菌體呈桿狀，長約2.0～4.0 μL，寬約0.7～1.0 μL(圖 1 A)；培養(yǎng)72 h后復(fù)紅染色觀察到芽孢(圖 1 B)，初步判定該菌為芽孢桿菌。

圖1 100倍顯微鏡觀察WTC019的菌體(A)與芽孢(B)Fig.1 The bacteria and spore in the 100 × microscope

2.2 菌株鑒定

由于該菌來自于秸稈堆土壤中，又具有明顯的芽孢形態(tài)，推測該菌可能為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。根據(jù)經(jīng)典的生理生化方法[5]對WTC019菌株進(jìn)行鑒定，用枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn (ATCC?23857TM)(又稱：Bacillussubtilis168)做對照，表1結(jié)果表明WTC019與枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn (ATCC?23857TM)的生理生化結(jié)果一致；PCR擴(kuò)增得到菌株WTC019的16S rRNA基因并測序(圖2)，發(fā)現(xiàn)該菌16S rRNA基因與枯草芽孢桿菌100%序列一致，MEGA軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，表明該菌與枯草芽孢芽孢桿菌最接近；16S rRNA基因分析并結(jié)合生理生化鑒定證實(shí)WTC019為枯草芽孢桿菌。

表2 WTC019生理生化鑒定Tab.2 Physiological and biochemical identification of WTC019

續(xù)表2

注： “+”表示陽性，“-”表示陰性

圖2 瓊脂糖電泳檢測16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products electrophoresis of 16S rRNA gene (CK：negative control)

2.3 WTC019對草魚生長的影響

表 2結(jié)果表明A組(對照組)增重率為(263.94±12.75)g，試驗(yàn)組B組、C組、D組的增重率分別為(301.37±18.02)%，(286.47±24.08)%，(294.57±20.87)%，與對照組相比分別增加了(37.43±5.27)%，(22.53±11.33)%，(30.63±8.12)% (圖4)；A組(對照組)特定生長率為(2.14±0.03)%/d，試驗(yàn)組B組、C組、D組的增重率分別為(2.31±0.03)%/d，(2.24±0.06)%/d，(2.27±0.02)%/d，與對照組相比分別增加了(0.17±0.03)%/d，(0.10±0.03)%/d，(0.13±0.02)%/d(圖5)；對照組與試驗(yàn)組在存活率上無差異。由此可知，試驗(yàn)組草魚的增重率和特定生長率均顯著高于對照組，其中B組的草魚增重率和特定生長率最高，分別達(dá)到(301.37±18.02)%和(2.31±0.03)% /d。

圖3 16sRNA進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree based on 16S rDNA

表3 枯草芽孢桿菌WTC019對草魚生長的影響Tab.3 Effects of B.subtilis WTC019 on growth of C.idellus

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 WTC019對草魚腸道消化酶的影響

由表4可知，A組(對照組)腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活力分別為(197.42±10.47)、(3.12±00.8)、(1302.75±54.81)U/mg；試驗(yàn)組B組(106CFU/g)腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活力分別為(340.49±20.12)、(4.55 ±0.11)、(2085 ±70.54)U/mg，與對照組相比分別增加了(72.4±10.19)%、(45.83±3.53)%、(60.04±5.41)%；C組(107CFU/g)腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活力分別為(428.76±27.48)U/g、(5.10 ±0.07)U/g、(2589 ±49.28)U/mg，與對照組相比分別增加了(117.15±13.92)%、(63.46±2.24)%、(98.73±3.78)%；D組(108CFU/g)腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活力分別為(447.45±19.79)U/g、(5.16±0.14)U/g、(2532.79±32.65)U/mg，與對照組相比分別增加了(126.65±10.02)%、(65.38±4.49)%、(94.41±2.51)%；由此可知，試驗(yàn)組草魚腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活力淀粉酶的增重率和特定生長率均顯著高于對照組，其中D組(108CFU/g)淀粉酶、脂肪酶活力增加最大，提高了(126.65±10.02)%、(65.38±4.49)%，C組(107CFU/g)腸道中胰蛋白酶的活力增加最大，提高了(98.73±3.78)%。

表4 枯草芽孢桿菌WTC019對草魚腸道消化酶的影響Tab.4 Effects of B.subtilis WTC019 on activities of digestive enzymes of C.idellus

2.5 WTC019對草魚抗氧化功能的影響

表 4 結(jié)果顯示，A組(對照組)草魚血清中過氧化氫酶活力為(5.87±0.51)U/mL，試驗(yàn)組B組(106CFU/g)、C組(107CFU/g)、D組(108CFU/g)的過氧化氫酶活力分別為(8.84±1.12)、(11.46±0.64)、(11.79±0.74)U/mL，與對照組相比分別增加了(50.60±9.08)%，(95.23±10.90)%，(100.85±12.61)%；A組(對照組)草魚血清中超氧化物歧化酶活力為(68.13±1.80)U/mL、試驗(yàn)組B組(106CFU/g)、C組(107CFU/g)、D組(108CFU/g)超氧化物歧化酶的活力分別為(74.84±3.41)、(84.37±3.05)、(95.96±4.47)U/mL，與對照組相比分別增加了(9.85±5.01)%，(23.84±4.48)%，(40.85±6.56)%；A組(對照組)草魚血清中谷胱甘肽過氧化物酶活力為(107.16±2.17)U/mL、試驗(yàn)組B組(106CFU/g)、C組(107CFU/g)、D組(108CFU/g)超氧化物歧化酶的活力分別為(110.45±7.47)、(117.61±5.67)、(109.10±7.77)U/mL，與對照組相比差異不顯著；A組(對照組)草魚血清中谷胱甘肽為(20.15±1.08)mg/L、試驗(yàn)組B組(106CFU/g)、C組(107CFU/g)、D組(108CFU/g)分別為(24.79±0.72)、(27.39±1.33)、(33.25±0.88)mg/L，與對照組相比分別增加了(23.03±3.57)%，(35.93±6.60)%，(65.01±4.37)%；由此可知，試驗(yàn)組草魚血清中過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽這三個(gè)抗氧化指標(biāo)均顯著高于對照組，其中D組(108CFU/g)過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽增加最大，與對照組相比分別提高了(100.85±12.61)%、(40.85±6.56)%、(65.01±4.37)%。

3 討論

大規(guī)模高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的過程中，為了防控魚病的爆發(fā)，往往在飼料中添加抗生素或者在養(yǎng)殖過程中使用一些抗生素和化學(xué)漁藥，尋找化學(xué)藥物及抗生素的替代品，建立健康友好的生態(tài)養(yǎng)殖模式，成為現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的必由之路?？莶菅挎邨U菌是一種應(yīng)用范圍很廣的益生菌。目前研究表明枯草芽孢桿菌能顯著提高西伯利亞鱘[7]、牙鲆幼魚[8]、大菱鲆[9]、對蝦[10-12]、羅非魚[13]、團(tuán)頭魴[14]、軍曹魚[15]、草魚[16-21]等多種魚類的生長速度。飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高草魚的生長性能，改變腸道微生物菌群，提高腸道消化酶活力，增加免疫因子和抗氧化因子的活性[16-19,21-24]，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌還能顯著改善養(yǎng)殖水體的水質(zhì)，減少水中病原菌的比例[24]。本研究結(jié)果表明在草魚基礎(chǔ)飼料中添加WTC019，草魚的增重率及相對生長速度顯著提高，腸道中消化酶的活性也顯著增強(qiáng)，抗氧化能力增強(qiáng)，飼料中添加該菌107CFU/g時(shí)，能起到很好的效果，這一數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22,25]略有出入，推測可能所用菌株不同所致。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的消化道中消化酶活性與飼料利用率和養(yǎng)殖效益密切相關(guān)，草魚消化道相關(guān)酶活性變化可以作為營養(yǎng)狀態(tài)指標(biāo)來指導(dǎo)草魚的養(yǎng)殖，改善飼養(yǎng)效果。本研究中飼料中添加枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組草魚腸道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活力淀粉酶均顯著高于對照組，淀粉酶與對照組相比分別增加了72.4%～126.65%；脂肪酶增加了45.83%～65.38%；胰蛋白酶的活力增加了60.04%～94.41%其中D組(108CFU/g)淀粉酶、脂肪酶活力增加最大，提高了(126.65±10.02)%、(65.38±4.49)%，C組(107CFU/g)腸道中胰蛋白酶的活力增加最大，提高了(98.73±3.78)%。芽孢桿菌在生長過程中可以向細(xì)胞外分泌多種酶類(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)和營養(yǎng)物質(zhì)(多種氨基酸和維生素)，這些物質(zhì)或許是芽孢桿菌提高草魚腸道消化酶活性的原因[17-20]。

抗氧化能力是評價(jià)動(dòng)物機(jī)體健康程度的重要指標(biāo)。 本研究中，飼料中添加B.subtilisWTC019喂食草魚60 d后，與對照組相比，試驗(yàn)組氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽含量均顯著高于喂食基礎(chǔ)飼料的對照組，但谷胱甘肽過氧化物酶的活性變化不顯著，這與絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致[17-20,22-24]。飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提升機(jī)體抗氧化能力的具體機(jī)制還不太清楚，可能原因有兩個(gè)方面：一方面，枯草芽孢桿菌進(jìn)入機(jī)體后通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的變化，增加腸道微生物群抗氧化酶的分泌，阻止脂質(zhì)過氧化和清除自由基從而增加魚體抗氧化的能力，另一方面，芽孢桿菌進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生的一些免疫因子可以刺激機(jī)體產(chǎn)生一些免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的能力。

4 結(jié)論

本研究分離到一株促進(jìn)草魚生長的益生菌枯草芽孢桿菌WTC019，并證實(shí)在草魚基礎(chǔ)飼料中添加該菌107CFU/g時(shí)，草魚的增重率及相對生長速度顯著提高，腸道中消化酶的活性也顯著增強(qiáng)，抗氧化能力增強(qiáng)。