孫墨可，李曉薇，孫曉文，張 曼，田 娟，董玉迪，李海燕*

(1.吉林省白城市農業(yè)科學院生物技術實驗室，吉林白城 137000；2.吉林農業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林長春 130118；3.吉林省鎮(zhèn)賚縣蘆葦濕地管理站，吉林鎮(zhèn)賚 137300)

靈芝是我國的傳統(tǒng)藥用真菌，在我國和東南亞國家有著悠久的應用歷史[1]。靈芝含有多糖、萜類化合物、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等多種活性成分。現代藥理研究表明，靈芝具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化、調節(jié)免疫及延緩衰老的作用[2-7]。自Mishra等[8]首次實現粗糙鏈孢霉(Neurosporecrassa)的 DNA 轉化以來，已經成功建立了許多絲狀真菌外源基因的遺傳轉化體系。近年來，研究人員對靈芝轉化方法進行了廣泛和深入的研究。Sun等[9]將電擊轉化方法引入靈芝的分子遺傳學研究中，獲得15個轉化子。Kim等[10]在靈芝中成功應用限制性內切酶介導的轉化方法，獲得4～17個轉化子。郭溆等[11]從靈芝中克隆了合成三萜的關鍵元件GLCYP450 及其還原酶 GLNADPH的基因，并在酵母中獲得了表達；方星等[12]利用農桿菌介導法將靈芝甾醇14α-脫甲基酶基因在靈芝中進行表達。逄春梅等[13]通過電擊法將雙元細菌人工染色體(BIBAC)載體上的100 kb人參大片段DNA轉化到靈芝原生質體內。筆者利用PEG轉化法將帶有GPD啟動子及GFP綠色熒光蛋白的表達載體pCAMBIA1302轉入靈芝原生質體中，以期為利用靈芝作為生物反應器表達蛋白及其中間產物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料靈芝(Goanodermalucidum)由吉林農業(yè)大學菌物研究所保存。大腸桿菌 DH5a 由吉林農業(yè)大學生物反應器保存。質粒pCAMBIA1302及TaqDNA聚合酶購自大連TaKaRa公司。

1.2菌株培養(yǎng)將靈芝菌絲接入PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為搖床120 r/min，28 ℃培養(yǎng)6 d。將大腸桿菌DH5a在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，在含有15%甘油的LB培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。

1.3引物序列PCR 引物均由金唯智公司合成，GPD啟動子引物為GPD - F：5′- GCTCTAGACGTTCGTGACTCGCAATATC-3′；GPD- R：5′- CGGGATCCTGCGGGTGAAAGAGGAGG-3′。

檢測靈芝轉化子GFP引物為GFP -F：5′- GTTGTATAATAGCACCCGGTTT -3′；GFP-R：5′- GGCTCGGTACGGAAGTTG -3′。

1.4平菇基因組DNA的提取將平菇菌種接種于液體PDA培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)6 d后，收集菌絲，采用TPS法提取平菇基因組。

1.5構建pCAMBIA1302重組表達載體

1.5.1PCR 擴增 GPD啟動子。根據已報道的平菇GPD啟動子序列設計2對引物，由金唯智公司合成，以平菇基因組 DNA為模板進行GPD啟動子片段的擴增。擴增程序為預變性94 ℃7 min；變性94 ℃45 s，退火65 ℃45 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min反應終止，于4 ℃保存。取2 μL擴增PCR產物進行1%的瓊脂電泳，檢測PCR擴增結果。電泳結果后連接T載體測序。

1.5.2雙酶切。將pCAMBIA1302質粒用NcoI 和BamH I于37 ℃進行過夜酶切，切膠回收大片段，用NcoI和BamH I限制性內切酶處理pSB1302質粒。 酶切后置于65 ℃水浴鍋中反應12 min使限制性內切酶失活。

1.5.3GPD啟動子連接pCAMBIA1302。用Solution Ⅰ 連接載體與基因，于4 ℃進行過夜連接，將連接產物加入到大腸桿菌感受態(tài)中進行轉化，過夜培養(yǎng)后，挑單菌落進行菌液PCR和酶切的驗證，鑒定結果為陽性則測序。

1.6靈芝原生質體潮霉素抗性篩選對靈芝原生質體再生培養(yǎng)基中的潮霉素抗性濃度進行篩選，分別選取濃度值為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 mg/mL的潮霉素放入固體MYG培養(yǎng)基中，將制備好的原生質體均勻地平鋪到MYG培養(yǎng)基中，5～7 d后觀察原生質體再生結果。

1.7PEG介導的靈芝原生質體轉化靈芝原生質體制備參照試驗前期得到的最優(yōu)靈芝原生質體制備方法進行[14]。取1×106個靈芝原生質體，放入MYG 液體培養(yǎng)基中，加入10～20 μg 待轉化的質粒，再加入 1 mL PEG 緩沖液(25% PEG4000，10 mmoL/L CaCl2，10 mmoL/L Tris-HCl，pH 7.4)，冰浴20 min。然后再加入1 mL PEG緩沖液，混勻后室溫放置5 min，4 000 r/min離心5 min 沉淀原生質體，最后重新懸浮原生質體于1 mL MYG再生培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)5 d，涂布含有40 mg/mL潮霉素的MYG再生平板。一般7～10 d后轉化子在抗性平板上長出。

1.8靈芝轉化子的鑒定

1.8.1PCR檢測靈芝轉化子。從帶有潮霉素抗性平板上挑取轉化子，利用CTAB法提取轉化子基因組DNA。以轉化子DNA為模板，利用引物GFP-F和GFP-R擴增GFP基因片段。擴增程序為預變性95 ℃ 5 min;變性94 ℃45 s，退火52 ℃ 45 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)；延伸72 ℃7 min反應終止，于4 ℃保存。

1.8.2熒光倒置顯微鏡觀察轉化的靈芝菌絲。在倒置顯微鏡下觀察轉化GFP綠色熒光蛋白的靈芝轉化子，觀察靈芝菌絲在倒置熒光顯微鏡下是否有熒光。

2 結果與分析

2.1TPS法提取平菇基因組TPS 是提取水稻基因組的一種方法，它是一種小量的快速簡單提取真菌基因組的方法，首次運用到提取平菇基因組，可以看出 TPS 法提取平菇基因組電泳條帶清晰，證明基因組提取成功(圖 1)。

注：M.DL10000 Marker；1～5.平菇基因組Note：M.DL10000 Marker； 1-5.Pleurotus ostreatus genome圖1 平菇基因組Fig.1 Pleurotus ostreatus genome

2.2pCAMBIA1302表達載體構建以 pCAMBIA1302為基礎表達載體，將其中的原啟動子 35s替換為GPD啟動子(圖2)。

圖2 表達載體 pCAMBIA1302 圖譜Fig.2 Construction of expression vector pCAMBIA1302

2.2.1GPD啟動子的克隆。根據已報道的GPD啟動子的序列設計引物GPD-F1和GPD-R1，并引入酶切位點NcoI和BamH I。經過Kan抗性篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)后抽提質粒，進行PCR、酶切鑒定并測序，得到正確的GPD啟動子(圖3)。

注：M.DL2000 Marker；1.GPD啟動子Note：M.DL2000 Marker；1.GPD promoter圖3 GPD 啟動子的 PCR 擴增檢測Fig.3 PCR amplification of GPD promoter

2.2.2pCAMBIA1302表達載體構建。提取重組 pCAMBIA1302 菌液質粒，分別經NocI和BamH I雙酶切后進行電泳檢測并測序表明，GPD啟動子已經成功構建到pCAMBIA1302 表達載體中(圖4)。

注：M.DL2000 Marker； 1～6.GPD 啟動子Note：M.DL2000 Marker；1-6.GPD promoter圖4 質粒 pCAMBIA1302上Nco I 和BamH I 雙酶切驗證Fig.4 The digestion verification of plasmid pCAMBIA1302 by Nco I and BamH I

2.2.3靈芝原生質體潮霉素抗性篩選。對靈芝原生質體再生培養(yǎng)基中的潮霉素抗性濃度進行篩選，結果表明靈芝原生質體在MYG再生培養(yǎng)基中，潮霉素的最低抑制篩選濃度為45 mg/mL(圖5)。

2.3靈芝轉化子的檢測通過 PEG 轉化法轉化靈芝原生質體，并在帶有潮霉素抗性的平板上培養(yǎng)，潮霉素抗性試驗表明，潮霉素對靈芝原生質體的最低抑制質量濃度為45 mg/mL。將假定轉化子轉接于含40 μg/mL 潮霉素篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選8 d，菌落能夠在抗性平板上繼續(xù)生長。隨機提取2個轉化子，用GFP片段進行PCR 檢測(圖6)。

圖5 靈芝原生質體在帶有潮霉素抗性培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 The growth of protoplast of G.lucidum in culture medium with hygromycin resistance

注：M.DL2000 Marker；1～2.靈芝轉化子 Note：M.DL2000 Marker；1-2.G. lucidum transformants圖6 靈芝轉化子中GFP的PCR驗證Fig.6 PCR detection of GFP in G.lucidum transformants

2.4熒光倒置顯微鏡觀察轉化的靈芝菌絲在熒光倒置顯微鏡下觀察轉化后GFP綠色熒光蛋白的靈芝轉化子，可以看出部分靈芝菌絲在倒置熒光顯微鏡下呈現熒光色，由此表明，GFP綠色熒光蛋白在靈芝菌絲中有表達(圖7)。

3 結論

利用TPS法提取平菇基因組，此方法簡單易行，適用于小量提取基因組。該研究建立了由PEG介導的靈芝轉化體系，首先將GPD啟動子構建到帶有GFP綠色熒光蛋白的pCAMBIA1302表達載體中，通過PEG介導的轉化法轉化靈芝原生質體，以及潮霉素的抗性篩選，獲得了一批具有潮霉素抗性的靈芝轉化子菌株，并通過PCR擴增GFP基因片段和熒光倒置顯微鏡試驗證實外源基因片段GFP已成功轉化進靈芝轉化子的基因組中。食用菌等大型絲狀真菌的轉化效率較低，遠遠低于絲細菌和酵母的轉化率，轉化效率高低也許與物種本身有關。該研究建立了靈芝轉化體系，使靈芝作為一種新的生物反應器，為今后分子生物學研究打下基礎。

注：A.靈芝轉化子；CK.未轉化的靈芝菌絲Note：A.G.lucidum transformants；CK.Untransformed G.lucidum mycelia圖7 在熒光倒置顯微鏡下觀察靈芝菌絲Fig.7 The mycelium of G. lucidum was observed under a fluorescence inverted microscope