程嘉慧，李卓妮，鄔明麗，高源，樊英智，李世鵬，賴振雨，雷初朝，黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

CDH11基因編碼E-鈣黏蛋白，屬于鈣粘蛋白超家族，對(duì)個(gè)體發(fā)育起著重要的作用：E-鈣黏蛋白是哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中第一個(gè)表達(dá)的鈣黏蛋白，可促進(jìn)小鼠8細(xì)胞胚胎時(shí)期的細(xì)胞黏合過程，調(diào)控鈣黏蛋白的種類與數(shù)量，可以決定胚胎細(xì)胞的黏著，影響細(xì)胞分化和器官的形成[1]。

牛的CDH11基因位于18號(hào)染色體上，含有11個(gè)外顯子。研究者們發(fā)現(xiàn)CDH11基因與成骨功能緊密相關(guān)，在MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)1周后CDH11表達(dá)增加伴ALP活性上調(diào)，提示在成骨分化期兩者具有協(xié)同性表達(dá)機(jī)制[1]，這種具有特異性的鈣粘蛋白在成骨細(xì)胞系中的表達(dá)及其在分化過程中的上調(diào)作用，表明該基因在骨的發(fā)育和維持中起特定功能[2]。同時(shí)，表達(dá)的蛋白可通過“同嗜”效應(yīng)介導(dǎo)骨的形成并維持微環(huán)境中不同種骨細(xì)胞的相互通訊和對(duì)話。

Alimperti.S等人研究發(fā)現(xiàn)CDH11基因表達(dá)的鈣粘蛋白-11是MSC分化成平滑肌細(xì)胞所必需的蛋白，說明基于鈣粘蛋白-11的粘附連接在MSC分化為SMC的過程中以及在含有SMC的組織的收縮功能中起到至關(guān)重要的作用，提示CDH11基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化具有潛在的意義[3]。陳子堅(jiān)等人研究發(fā)現(xiàn)CDH11基因促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲，與膀胱癌分級(jí)、分期、復(fù)發(fā)、進(jìn)展等指標(biāo)呈正相關(guān)，提示CDH11也許可以作為預(yù)測(cè)膀胱癌的生物標(biāo)記物[4]。Craciun.F等人的研究表明，CDH11是CKD特征性腎纖維化的新型尿生物標(biāo)志物[5]。Assefnia.S等人發(fā)現(xiàn)CDH11基因與發(fā)育中的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，惡性腫瘤的擴(kuò)散和癌癥干細(xì)胞相關(guān)，也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的具有快速檢測(cè)潛力的治療靶標(biāo)[6]。Li.Y研究表明鈣粘蛋白-11作為細(xì)胞-細(xì)胞粘附分子優(yōu)先在基底樣乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，并通過促進(jìn)小GTP酶Rac活性促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移[7]。這些研究表明CDH11基因表達(dá)的鈣黏蛋白-11在癌癥細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，并且是許多癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物，在人類醫(yī)學(xué)上具有重要研究?jī)r(jià)值。

國(guó)外肉牛群體中基于大群體GWAS分析鑒定結(jié)果表明[8]，CDH11基因可能是影響肉牛體尺性狀的重要基因。結(jié)合CDH11基因?qū)ε咛r(shí)期的成骨細(xì)胞系的發(fā)育、促進(jìn)胚胎細(xì)胞緊密黏合等生物學(xué)過程起到重要的作用，提示該基因可能參與牛早期胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)過程，對(duì)牛的成骨過程和器官形成產(chǎn)生重要的作用，從而影響牛的斷乳期體重、飼喂效率以及死胎率。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)CDH11基因的研究主要集中在小鼠的神經(jīng)疾病分析以及成骨作用和關(guān)節(jié)炎病理分析上，對(duì)秦川牛CDH11基因外顯子多態(tài)性的研究還未見報(bào)道，因此本研究將初步鑒定CDH11基因在秦川牛群體中的遺傳變異，并分析其基因頻率、基因型頻率，檢測(cè)研究的位點(diǎn)是否符合哈代-溫伯格平衡，研究其遺傳多態(tài)性水平，為今后針對(duì)秦川牛開發(fā)出適用于中國(guó)肉牛選育的分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中所使用的牛血液樣本取自247頭秦川牛。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 使用北京艾德萊生物科技有限公司全血/組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取秦川牛個(gè)體的血樣DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)出2對(duì)引物，基因的序列信息來(lái)自NCBI(GeneBank登錄號(hào)：NC_007316.6)，引物信息見表1。

表1 牛CDH11基因引物序列

引物合成完成后，以秦川牛的混合DNA池(由50個(gè)不同DNA的樣本各1 μL混合成一個(gè)DNA池)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增總體積共12.5 μL：其中包括12 μL體系和0.5 μL的混合DNA池模板。體系組成為：6.25 μL 2×Taq Master Mix(2×PCR緩沖液，3 mmol/L MgCl2，1UTaq DNA 聚合酶和400μmol/L dNTP 混合物)，4.75 μLddH2O，上下游引物各0.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 5 min；95℃變性30 s；退火55℃30 s；再于72℃延伸30 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。PCR完成后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，使用1%PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 PCR-RFLP分析 根據(jù)NCBI上的序列信息，發(fā)現(xiàn)了位于第二個(gè)外顯子上的第32935629位基因的SNP突變。采用PCR-RFLP分析對(duì)247個(gè)秦川牛樣品進(jìn)行分型。使用Xcm-1為限制性內(nèi)切酶，酶切體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，1 μL buffer緩沖液，1.5 U(5 000 U/mL)限制性內(nèi)切酶，4μL ddH2O。置于37℃酶切3 h，酶切產(chǎn)物使用1%PAGE電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)分型結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel等軟件分析遺傳多態(tài)性指標(biāo)，對(duì)于分型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別計(jì)算出基因型頻率和基因型頻率。利用SHEsis在線軟件檢測(cè)群體是否符合哈代-溫伯格平衡，使用MSRcall在線數(shù)據(jù)分析(www.msrcall.com/)進(jìn)行SNP突變位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

在秦川牛的CDH11基因外顯子2(g.32935629 C>T)上鑒定了1個(gè)SNP,對(duì)此SNP位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了分析。圖1顯示了該SNP位點(diǎn)的變異情況及其酶切分型多態(tài)性結(jié)果，基因測(cè)序結(jié)果顯示該SNP突變位點(diǎn)是C>T型的突變。

此SNP位點(diǎn)適合選用限制性內(nèi)切酶Xcm-1進(jìn)行酶切分型，酶切位點(diǎn)的分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表2。結(jié)果表明：該SNP突變位點(diǎn)存在3種基因型(WW，WD，DD)。

統(tǒng)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的基因型，計(jì)算基因型頻率和基因頻率，并利用SHEsis在線軟件檢測(cè)群體是否符合哈代-溫伯格平衡，結(jié)果如表3所示。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此SNP突變位點(diǎn)上的W等位基因是優(yōu)勢(shì)等位基因，在三種基因型中，野生型WW所占比重較大，WD次之，DD基因型個(gè)體最少，在247頭秦川牛中僅發(fā)現(xiàn)1例。純合子突變(DD)的基因型頻率很低，僅為0.004；而雜合子(WD)的基因型頻率較高，為0.117。χ2檢驗(yàn)顯示，所檢測(cè)的秦川牛此位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P> 0.05)。

利用MSRcall在線數(shù)據(jù)分析(www.msrcall.com/)進(jìn)行該位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析，得到的結(jié)果如表4所示。PIC多態(tài)信息含量結(jié)果顯示，所檢測(cè)的秦川牛在該位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性呈低度多態(tài)(PIC<0.25)。

表2 牛CDH11基因PCR-RFLP多態(tài)性

表3 牛CDH11基因型和等位基因頻率，以及基因多態(tài)性位點(diǎn)的哈代-溫伯格平衡檢測(cè)

表4 牛CDH11基因遺傳多態(tài)性分析

圖1 CDH11基因外顯子2(g.32935629 C>T)處SNP檢測(cè)和擴(kuò)增產(chǎn)物Xcm-1 PCR-RFLP電泳分析

3 討論

CDH11基因表達(dá)的E-鈣黏蛋白由N端的胞外結(jié)構(gòu)域，以及高度保守的C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。目前，已有超過100種鈣黏蛋白分子在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。鈣黏蛋白家族各個(gè)組分之間的比例對(duì)動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育起到重要的調(diào)節(jié)作用，提示CDH11基因可能與肉牛體尺發(fā)育有關(guān)。許多研究也發(fā)現(xiàn)由CDH11基因所表達(dá)的鈣黏蛋白-11在膀胱癌、乳腺癌等癌癥細(xì)胞的遷徙轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可以作為許多癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病診療過程中的生物標(biāo)記物，說明CDH11在機(jī)體中發(fā)揮著多種功能。

本研究對(duì)247頭秦川?；蚪M中CDH11基因外顯子2(g.32935629 C>T)上的SNP突變進(jìn)行多態(tài)性分析，利用Xcm-1限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)分型，采用1%PAGE電泳檢測(cè)酶切分型結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)共有3種基因型，其中未突變個(gè)體占絕大多數(shù)，雜合突變基因型WD的頻率為0.117，而純合突變DD的基因型頻率為0.004，純合突變基因型數(shù)量極少。進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)群體處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P > 0.05)。進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)信息含量(PIC)該指標(biāo)為0.111，說明秦川牛CDH11基因外顯子2(g.32935629 C>T)該位點(diǎn)的SNP突變?yōu)榈投榷鄳B(tài)(PIC<0.25)。

肉牛業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，但目前我國(guó)大量繁育的地方肉牛品種普遍存在著體格小，生長(zhǎng)速度緩慢，屠宰率和凈肉率較為低下等缺點(diǎn)，難以滿足現(xiàn)代肉牛業(yè)的發(fā)展和人民生活的需求，因此開發(fā)有效的生長(zhǎng)發(fā)育分子標(biāo)記具有重要意義。國(guó)外肉牛群體中GWAS分析提示CDH11可能和肉牛生長(zhǎng)發(fā)育有密切關(guān)系，因此在國(guó)內(nèi)優(yōu)秀肉牛品種中調(diào)查該基因多態(tài)具有重要意義，本研究結(jié)果表明在我國(guó)秦川牛品種中，CDH11基因外顯子2(g.32935629 C>T)上存在多態(tài)，該突變呈現(xiàn)低度多態(tài)，且純合突變率極低。本研究結(jié)果可以為下一步開發(fā)研究針對(duì)秦川牛品種的遺傳分子標(biāo)記提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)思路。