冉景盛，王慧超，陳今朝，冉明才，陳 春

（1.長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100；2.重慶市彭水第一中學(xué)校，重慶 409600）

0 引言

靈芝（Ganoderma lucidum） 含有多糖、核苷和三萜化合物等物質(zhì)，靈芝多糖主要的生物活性成分具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤和延緩衰老等功能[1-2]。但靈芝人工栽培周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、品質(zhì)不穩(wěn)定[3]。液體發(fā)酵法制備靈芝菌絲體不僅周期短、成本低，而且多糖、三萜等物質(zhì)含量更高。銀杏（Ginkgo）葉含黃酮類化合物、萜內(nèi)酯類化合物，具有抗氧化、降血糖和調(diào)血脂等作用，可以治療血栓、改善心腦血管循環(huán)功能。以靈芝、銀杏葉和還原牛乳制備營(yíng)養(yǎng)豐富、口味新穎的保健飲料，為促進(jìn)靈芝、銀杏葉深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝菌種：靈芝子實(shí)體于2016年8月采自重慶市石柱縣大風(fēng)堡，并在生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保藏；銀杏葉：2017年9月2日采自長(zhǎng)江師范學(xué)院校園；發(fā)酵菌劑為保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌（1∶1），生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏；脫脂乳粉，購(gòu)于涪陵區(qū)馬鞍超市。

TYS-100型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司產(chǎn)品；TGC-16C型臺(tái)式離心機(jī)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JY96-IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波生物科技有限公司產(chǎn)品；GYB40-OS型高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠產(chǎn)品；ZSD-1090型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 工藝流程

①靈芝菌絲體→離心→烘干→粉碎→超聲波提取→過(guò)濾→多糖提取液；

②脫脂乳粉→復(fù)原→加蔗糖→加穩(wěn)定劑；

③銀杏葉→清洗→烘干→粉碎→超聲波提取→過(guò)濾→黃酮提取液；

①+②+③→調(diào)配→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→感官鑒定→成品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝菌絲體制備

將靈芝斜面菌種0.5 cm2種塊接入液體培養(yǎng)基100 mL于250 mL三角瓶，在28℃，轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)120 h。將發(fā)酵液過(guò)濾、洗滌菌絲球，于105℃條件下烘干，備用。

1.3.2 pH值對(duì)靈芝多糖產(chǎn)量的影響

將 pH 值為 3.4，3.8，4.2，4.6，5.0，5.4，5.8，6.2，6.6，7.0培養(yǎng)液分別置于250 mL錐形瓶中，接種10.0%發(fā)酵菌劑；于28℃條件下培養(yǎng)120 h，測(cè)定菌絲體生物量、多糖產(chǎn)量。

1.3.3 菌絲體多糖提取液的制備

將發(fā)酵液用150目濾網(wǎng)過(guò)濾，用蒸餾水洗滌菌絲體3次，于80℃條件下真空干燥至恒質(zhì)量；按料液比為1∶15（W/V），稱菌絲體干粉，加蒸餾水置圓底燒瓶中；于60℃條件下超聲提取2次，每次25 min；過(guò)濾，合并濾液，得多糖提取液，備用。

1.3.4 銀杏葉黃酮提取液的制備

將新摘銀杏葉分選、清洗，于105℃條件下烘干至恒質(zhì)量，粉碎過(guò)60目篩；按料液比為1∶6（W/V），稱取銀杏葉粉于250 mL錐形瓶中，加95%乙醇；超聲波提取時(shí)間分別為30，20，10 min；過(guò)濾，合并濾液，減壓蒸餾得黃酮提取液，備用。

1.3.5 發(fā)酵菌劑制備

將保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌（1∶1） 接種于無(wú)菌還原乳中，于42℃恒溫條件下培養(yǎng)2 d，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 乳飲料發(fā)酵培養(yǎng)基制備

將多糖提取液、黃酮提取液、牛乳和蔗糖混勻，水浴預(yù)熱，在65℃，20 MPa條件下均質(zhì)15 min。

1.3.7 滅菌

將均質(zhì)液于80℃水浴加熱15 min，冷卻至40～42℃。

1.3.8 接種發(fā)酵

將均質(zhì)液分裝于瓶中，接入4.0%的發(fā)酵菌劑，于42℃恒溫條件下培養(yǎng)4 h。

1.3.9 不同因素添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

（1）多糖提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響。將黃酮提取液4.0%，蔗糖10.0%，β-環(huán)狀糊精和還原乳0.080%混勻，分別加入2.0%，4.0%，6.0%，8.0%的多糖提取液，接入4.0%的發(fā)酵菌劑，于42℃恒溫條件下培養(yǎng)4 h。根據(jù)飲料的顏色、乳清析出、組織狀態(tài)、氣味和口味進(jìn)行評(píng)分，確定多糖提取液的適宜添加量。

（2）黃酮提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響。將多糖提取液4.0%，蔗糖10%，β-環(huán)狀糊精和還原乳0.080%混勻，分別加入3.0%，4.0%，5.0%，6.0%的黃酮提取液，按上述方法接種、培養(yǎng)，評(píng)定飲料質(zhì)量，確定黃酮提取液的添加量。

（3）蔗糖添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響。將多糖提取液4.0%，黃酮提取液4%，β-環(huán)狀糊精和還原乳0.080%混勻，分別加入6.0%，8.0%，10.0%，12.0%的蔗糖，按上述方法接種、培養(yǎng)，評(píng)定飲料的品質(zhì)，確定蔗糖的添加量。

（4）還原乳添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響。將多糖提取液4.0%，黃酮提取液4.0%，蔗糖10.0%和β-環(huán)狀糊精0.080%混勻，分別加入10.0%，12.0%，14.0%，16.0%的還原乳，按上述方法接種、培養(yǎng)，評(píng)定飲料的品質(zhì)，確定還原乳的添加量。

1.3.10 最適配方的確定

選取多糖提取液添加量、黃酮提取液添加量、蔗糖添加量和發(fā)酵菌劑接種量4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。根據(jù)感官品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，確定最適配方。

L9（34）正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L（934）正交試驗(yàn)因子與水平設(shè)計(jì)/%

1.3.11 冷藏后熟、鑒定

將發(fā)酵乳飲料迅速降溫至10℃以下，于4℃冰箱冷藏后熟24 h，測(cè)定合格為成品。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

用感官評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)飲料的品質(zhì)。根據(jù)飲料的顏色、乳清析出、組織狀態(tài)、氣味和口味綜合評(píng)分，10人評(píng)分，總分為100分。

飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.4.2 理化指標(biāo)

靈芝多糖：采用苯酚-硫酸法測(cè)定；黃酮：采用紫外分光光度法測(cè)定；蛋白質(zhì)：按GB/T 5009.5—2003測(cè)定；脂肪酸、含乳固形物和酸度：均按GB/T4 789.2003測(cè)定。

表2 飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 微生物指標(biāo)

致病菌：按GB/T 4789.4檢測(cè)；大腸菌群：按GB/T 4789.3檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)菌絲體干質(zhì)量、多糖產(chǎn)量的影響

當(dāng)培養(yǎng)液的pH值為5.4時(shí)，菌絲體生物量最大，為2.401 7 g/100mL；pH值為5.4時(shí)，多糖產(chǎn)量為0.235 2 g/100 mL。因此，適宜pH值為5.4。

pH值對(duì)菌絲體生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 pH值對(duì)菌絲體生長(zhǎng)、多糖產(chǎn)量的影響

2.2 單因子試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 多糖提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

添加4.0%多糖提取液時(shí)，乳飲料感官品質(zhì)較好。多糖提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)表3。

2.2.2 黃酮提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

添加3.0%黃酮提取液時(shí)，飲料的感官品質(zhì)較好。黃酮提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)表4。

2.2.3 蔗糖添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

添加10.0%的蔗糖時(shí)，飲料的感官品質(zhì)較適宜。蔗糖添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)表5。

2.2.4 接種量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

表3 多糖提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

表4 黃酮提取液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

表5 蔗糖添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

接種量為2.0%對(duì)飲料的感官品質(zhì)較適宜。

發(fā)酵菌劑接種量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)表6。

表6 發(fā)酵菌劑接種量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

各因子影響順序?yàn)?RB＞RC＞RD＞RA，即黃酮提取液添加量＞蔗糖添加量＞發(fā)酵菌劑接種量＞多糖提取液添加量。最佳發(fā)酵工藝配方為A2B1C2D3，即多糖提取液添加量4.0%，黃酮提取液添加量3.5%，蔗糖添加量10.0%，發(fā)酵菌劑接種量3.0%。

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表7。

2.4 產(chǎn)品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

表7 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析

感官指標(biāo)：乳白色，顏色純正，有光澤；無(wú)乳清析出；質(zhì)地均勻、穩(wěn)定；靈芝、銀杏葉香味較淡，香味協(xié)調(diào)；口感清爽，酸甜適。

理化指標(biāo)：靈芝多糖含量≥0.15%，黃酮含量≥0.002 0%；蛋白質(zhì)含量≥3.6%，脂肪含量≥0.20%，含乳固形物含量≥8.0%，總酸度80～90°T。

微生物指標(biāo)：乳酸菌數(shù)≥1×108個(gè)/mL，細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/mL，大腸菌群數(shù)≤6個(gè)/100 mL，致病菌不得檢出。

3 結(jié)論

靈芝菌絲體銀杏葉發(fā)酵乳飲料的最佳發(fā)酵工藝配方為靈芝菌絲體多糖提取液添加量4.0%，銀杏葉黃酮提取液添加量3.5%，蔗糖添加量10.0%，還原乳添加量12.0%，β-環(huán)狀糊精0.080%，發(fā)酵菌劑接種量4.0%，于42℃恒溫條件下培養(yǎng)4 h；此時(shí)乳飲料為乳白色，組織狀態(tài)、質(zhì)地均勻，無(wú)乳清析出；具有清爽的銀杏葉和靈芝香味，營(yíng)養(yǎng)豐富、酸甜適宜、風(fēng)味獨(dú)特。