潘潤桑，陳致瑜，羅振華，余福勛，楊 斌，聶瑛潔△，田曉濱▲

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院，貴陽 550001)

骨肉瘤是一種常見的骨組織惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、惡性程度高、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點，早期診斷和治療較困難[1]。目前雖然有多種手術(shù)及化療治療方式，但總體治療效果不理想[2]。目前順鉑仍為骨肉瘤臨床治療常用化療藥，且聯(lián)合用藥對骨肉瘤的治療將會取得更好的療效。近年來發(fā)現(xiàn)一些中藥制劑對骨肉瘤的治療有一定效果，是目前較為熱門的一種新輔助療法[3]。羥喜樹堿是一種能選擇性抑制DNA Topo1功能的天然化合物[4]，目前已廣泛應(yīng)用于臨床并取得一定治療效果。羥喜樹堿能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞，對肝癌、胃癌、白血病[5-8]等多種腫瘤均有明顯的抑制作用。而羥喜樹堿在骨肉瘤的治療作用目前仍不清楚，本實驗通過一系列體外實驗探討羥喜樹堿對骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 實驗所用骨肉瘤細(xì)胞系HOS細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；羥喜樹堿(純度99.91%)購自美國SELLECK公司(批號：S2423)；順鉑購自美國Sigma公司(貨號：p4394)；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CCK-8試劑盒(300T)購自日本Dojindo公司；GAPDH、Cleaved-Caspase3，山羊抗鼠、山羊抗兔等抗體均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將骨肉瘤HOS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的25 mL培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻貼壁生長，隔天換液，換液時使用PBS清洗。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。羥喜樹堿單藥實驗分為空白組，10、20、40、80 μmol/L等濃度組。羥喜樹堿聯(lián)合順鉑實驗分為空白組，羥喜樹堿組(40 μmol/L)，順鉑組(40 μmol/L)及聯(lián)合用藥組(羥喜樹堿40 μmol/L+順鉑40 μmol/L)。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞活力 胰酶消化細(xì)胞后，中和制備細(xì)胞懸液，計數(shù)。96孔板內(nèi)每孔接種5 000個細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，按此方法種植HOS細(xì)胞于96孔板。分別于24、48、72 h時檢測吸光度值(A值)。每孔加入CCK-8 工作液100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀下檢測波長450 nm處A值。

1.2.3平板克隆細(xì)胞集落形成實驗 胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后稀釋至1×103個/mL。在6 cm培養(yǎng)皿中加入1 000個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后分別給藥。培養(yǎng)2周后，以4%多聚甲醛固定30 min，2%結(jié)晶紫染色30 min，洗凈烘干后拍照。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 加藥處理24、48、72 h，收集上清液于流式管，PBS清洗后加1 mL不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，中和后收集于流式管，800 r/min離心5 min，棄上清液。PBS清洗干粉，800 r/min離心5 min，棄上清液。每組加入200 μL 1×Binding Buffer,在Buffer中加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，混勻；4 ℃避光反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，記錄結(jié)果。

1.2.5Western blot 提取各實驗組細(xì)胞的蛋白，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜，一抗4 ℃搖床孵育16 h，二抗室溫孵育1 h，洗膜，在化學(xué)發(fā)光試劑盒電化學(xué)發(fā)光(ECL)液中于凝膠成像系統(tǒng)下曝光，以GAPDH為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1羥喜樹堿對HOS細(xì)胞增殖的影響 與空白組比較，不同濃度羥喜樹堿作用均出現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.05)，且細(xì)胞活性隨著時間及濃度的增加逐漸降低(P<0.05)。隨著羥喜樹堿濃度的增加，HOS細(xì)胞克隆形成的細(xì)胞團(tuán)明顯減小，細(xì)胞集落數(shù)量形成逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：CCK-8檢測細(xì)胞活力；B：平板克隆細(xì)胞集落形成實驗

2.2羥喜樹堿對HOS細(xì)胞凋亡的影響 隨著羥喜樹堿濃度的增加，HOS細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率分別為7%、17%、26%、34%、53%；凋亡相關(guān)蛋白Caspase3剪切體表達(dá)逐漸增加；與空白組相比，其余組Caspase3剪切體、Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.05),40、80 μmol/L組更為明顯(P<0.01)，見圖2。

2.3羥喜樹堿聯(lián)合順鉑對HOS細(xì)胞增殖的影響 與空白組比較，羥喜樹堿組、順鉑組及聯(lián)合用藥組均在不同時間對HOS細(xì)胞出現(xiàn)抑制作用。羥喜樹堿組及聯(lián)合用藥組的抑制率分別為(65.5±3.9)%和(73.0±4.6)%，聯(lián)合用藥組對細(xì)胞活力抑制作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組相比于其他組，HOS細(xì)胞克隆形成的細(xì)胞團(tuán)明顯減小(P<0.05)，見圖3。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測相關(guān)蛋白

A：CCK-8檢測細(xì)胞活力；B：平板克隆細(xì)胞集落形成實驗

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測相關(guān)蛋白

2.4羥喜樹堿HYD聯(lián)合順鉑對HOS細(xì)胞凋亡的影響 與羥喜樹堿組、順鉑組相比，聯(lián)合用藥組HOS細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例最高(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Caspase3剪切體、Bax表達(dá)量最高(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

骨肉瘤好發(fā)于青少年，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤疾病之一[9]。目前的治療方式主要為手術(shù)切除及放化療[10]。雖然化療方式有一定效果，然而治療效果仍較差，有效率60%左右[11]。因此，尋找新的抗骨肉瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的藥物顯得尤為重要。

羥喜樹堿是我國自主研發(fā)的新型抗腫瘤藥物，其藥理學(xué)功能主要是不可逆的抑制DNA復(fù)制[12]。目前在臨床有較為廣泛的應(yīng)用，尤其在腫瘤的治療中有一定的成效。在結(jié)直腸的聯(lián)合化療中，羥喜樹堿聯(lián)合奧沙利鉑與單用奧沙利鉑組相比，其誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加[13]。有文獻(xiàn)報道羥喜樹堿抑制肝癌細(xì)胞增殖具有濃度依賴性，并能引起細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡相關(guān)改變[14]。目前，由于其在腫瘤治療存在一定的有效性，近年研制出了片劑、滴丸、固體分散片、脂質(zhì)體、納米體等一系列新劑型[15]。羥喜樹堿對治療多種惡性腫瘤具有明顯療效，然而其在骨肉瘤中的臨床作用仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示，隨著羥喜樹堿濃度的增加和作用時間的延長，其對細(xì)胞的抑制作用逐漸增加，呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性，細(xì)胞集落形成數(shù)量及大小均降低，細(xì)胞凋亡比例明顯增高，凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Bax表達(dá)逐漸增加，Bcl2表達(dá)逐漸降低，表明羥喜樹堿促進(jìn)HOS細(xì)胞的凋亡，提示羥喜樹堿對骨肉瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。羥喜樹堿在聯(lián)合順鉑用藥后，顯示出了更加明顯的抑制腫瘤增殖的反應(yīng)。

以上實驗均表明羥喜樹堿能夠在體外抑制骨肉瘤HOS細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，聯(lián)合順鉑用藥較單用順鉑化療效果更佳，為臨床治療骨肉瘤提供新的思路和實驗基礎(chǔ)。然而具體相關(guān)機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。