江龍綜述，王綠婭、程曉曙審校

家族性高膽固醇血癥（FH）是常染色體單基因顯性遺傳病，主要致病基因為低密度脂蛋白受體（LDLR）基因，其主要臨床特征是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平極度升高，引起全身嚴(yán)重動脈粥樣硬化（AS）和早發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[1，2]。FH分為純合（HoFH）與雜合兩種類型，雜合FH患病率約為1/200，HoFH患病率僅為1/16萬～30萬[3，4]。但FH的早期診斷率及治療率僅為10%～15%[1]，作為冠心病的高危人群，目前仍未引起人們足夠重視。FH與其他高脂血癥不同，2013年歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會（EAS）共識強調(diào)了“累積LDL-C負(fù)擔(dān)”的概念，正常人55 歲時累積LDL-C 負(fù)擔(dān)為160 mmol/L即可發(fā)生冠心?。–HD），由于患者從出生就沉浸在高LDL-C水平下，若不治療，HoFH患者12歲LDL-C就可累積到160 mmol/L而發(fā)生CHD，雜合FH患者35歲時即可發(fā)生CHD[1]。近年來，國際動脈粥樣硬化學(xué)會、EAS等國際組織頒布多項FH防治指南和共識，強調(diào)需強化FH管理[3-5]。按照FH全球發(fā)病率1/200計算，我國有超過300萬潛在FH患者，遺傳負(fù)擔(dān)相當(dāng)沉重。2013年EAS制定的FH診治共識認(rèn)為我國大陸FH診斷率和治療率非常低，甚至低于中國臺灣和中國香港[1]。此外，我國FH研究現(xiàn)狀系統(tǒng)評價顯示，截止2014-12底，大陸報道FH總例數(shù)約100例，大多為病例報道和綜述類研究[6]。中國作為世界上人口最多的國家，承受FH 遺傳負(fù)擔(dān)可能比其他國家更為嚴(yán)重。除開展必要的防治宣傳外，對FH治療方法的探索也是分子生物學(xué)重要的課題之一。

1 家族性高膽固醇血癥基因治療的探索

目前的藥物治療很難使FH患者的LDL-C水平達(dá)到指南建議的目標(biāo)值，特別是HoFH患者，即使他汀聯(lián)合依折麥布僅能降低LDL-C水平30%～40%[4]；新近報道的在他汀基礎(chǔ)上加用前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制劑可降低LDL-C水平約50%[7]；脂蛋白血漿置換術(shù)通過體外脂蛋白分離能夠有效降低HoFH患者血液中LDL-C水平55%～70%，但需要每2周1次，和PCSK9抑制劑一樣存在花費巨大的問題[8]；肝臟移植可改善HoFH患者的LDL代謝，但由于缺乏供體及免疫排斥反應(yīng)而難以推廣。因此，探索一種安全有效的新型療法勢在必行。

肝臟是調(diào)整膽固醇代謝的主要器官，人體約70%的LDL-C由肝臟上的LDLR基因代謝。因此，目前的FH基因治療策略主要圍繞肝臟上補充正常的人LDLR。最早在1995年，有學(xué)者通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將表達(dá)人LDLR基因輸入5例HoFH患者肝臟，令人失望的是僅有3例患者有輕度的LDL-C降低（6%～25%）[9]；有學(xué)者在動物模型中證實以腺相關(guān)病毒8（AAV8）為載體，攜帶重組LDLR基因至LdLr-/-/載脂蛋白B信使核糖核酸（mRNA）編輯的催化多肽-1（Apobec1）-/-小鼠模型肝臟，可有效改善AS進(jìn)展[10]。基于此，在2016年開展了一項以AAV8為載體的對FH基因治療臨床試驗（NCT02651675），目前效果尚未公布。但是病毒載體具有潛在的免疫源性以及細(xì)胞毒性作用，安全性方面還有待深入研究。此外，一些非病毒載體的基因療法已在FH動物模型中驗證了其有效性和安全性，如我國團隊最近采用體積更小的微循環(huán)DNA載體裝載正常的LDLR基因，導(dǎo)入到高脂飲食的C57BL/6 LdLr-/-小鼠體內(nèi)，在15周左右小鼠LDL-C水平維持在2.3～3.9 mmol/L之間，且未檢測到顯著的毒性反應(yīng)[11]?？傊?，F(xiàn)H的基因治療策略的探索已經(jīng)嶄露頭角，具有廣闊的前景，但其臨床療效和安全性還有待深入的探索。

2 微小核糖核酸（miRNAs）或為治療的新靶點

近年發(fā)現(xiàn)的miRNAs揭開了真核生物基因表達(dá)新的調(diào)控方式，極大地豐富了人們對基因表達(dá)調(diào)控新的認(rèn)識。miRNAs是長度為18～22核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過堿基互補配對的方式與靶基因3’端非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄、降解及抑制蛋白翻譯[12]。以下將主要圍繞miRNAs與LDL-C代謝以及目前與FH的臨床研究進(jìn)展逐一進(jìn)行闡述（圖1）。

2.1 miRNAs與LDL-C代謝

FH主要致病基因為LDLR，占75%以上；其他致病基因還包括載脂蛋白B100（ApoB100）和PCSK9等。以上任何一個基因有害突變，均可引起LDLR的表達(dá)和功能異常，導(dǎo)致循環(huán)LDL清除障礙，引發(fā)LDL-C水平升高，最終導(dǎo)致CHD發(fā)生?，F(xiàn)圍繞影響以上三個主要基因的miRNAs進(jìn)行闡述。

LDLR基因相關(guān)的miRNAs：LDLR是體內(nèi)LDL-C清除的關(guān)鍵受體，如能通過miRNAs提高自身LDLR的表達(dá)，將是一個潛在的治療策略。目前體外細(xì)胞實驗證實直接或間接影響LDLR基因表 達(dá) 的 miRNAs 包 括：miR-27a/b[13]、miR-128-1[14]、miR-148a[14]、miR-130b[14]、miR-301b[14]、miR-185[15]、miR-195[16]及 miR-199a/b[17]；而經(jīng)過動物體內(nèi)驗證最終能有效影響LDL-C代謝的僅有以下三個：miR-128-1[14]、miR-148a[14]、miR-185[15]；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-128-1可顯著升高LDLR的表達(dá)，降低循環(huán)極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）和LDL-C水平；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-148a可顯著升高LDLR和腺苷三磷酸（ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）的表達(dá)，從而減少循環(huán)中的LDL-C水平和升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；在ApoE-/-的小鼠模型中抑制miR-185可明顯降低循環(huán)LDL-C水平，并且延緩動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

ApoB基因相關(guān)的miRNAs：載脂蛋白B（ApoB）的組裝和分泌對于飲食和內(nèi)源性來源的脂質(zhì)運輸至關(guān)重要，因此抑制ApoB的表達(dá)和活性，可有效的控制循環(huán)中膽固醇水平。目前體內(nèi)實驗證實主要有三個miRNAs與ApoB基因相關(guān)：miR-30c[18]、miR-34a[19]和 miR-122[20]；體內(nèi)在 C57BL/6 小鼠模型中，通過慢病毒過表達(dá)miR-30c可顯著降低ApoB的表達(dá)和活性，還可降低血漿膽固醇和VLDL水平；在ApoE-/-的小鼠模型中過表達(dá)miR-30c的結(jié)果與上述模型的結(jié)果一致，并且觀察到可以縮減AS斑塊；在LdLr-/-小鼠模型中過表達(dá)miR-34a可顯著降低循環(huán)膽固醇，甘油三酯（TG）以及ApoB水平，并且可縮減AS斑塊負(fù)荷；對普通飼料喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi)抑制miR-122，4周后的顯著降低體內(nèi)LDL-C、ApoB及TG水平。

PCSK9相關(guān)的miRNAs：PCSK9作為一個水解酶，在生理情況下可降解細(xì)胞膜上過多的LDLR表達(dá)，而有效抑制PCSK9的表達(dá)和活性，將提升LDLR的表達(dá)，從而達(dá)到降低循環(huán)LDL-C的目的。體外細(xì)胞實驗已證實miR-224直接靶向PCSK9的mRNA，從而降低PCSK9表達(dá)[21]；而miR-195和 miR-27a均可上調(diào) PCSK9 的表達(dá)[16，22]；miR-132 和 miR-499可間接下調(diào)PCSK9轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）的表達(dá)[23]。此外，來自巴西的學(xué)者預(yù)測了一些與PCSK9的mRNA3‘UTR區(qū)域結(jié)合的miRNAs[24]。可能由于PCSK9研究起步較晚，因此miRNAs與其相關(guān)的研究不多，鑒于其抑制劑在臨床使用中非常有效，期待今后更多體內(nèi)的研究探討miRNAs與PCSK9的關(guān)系。

2.2 miRNAs與HDL-C

研究表明，HDL 對動脈血管壁有直接的保護(hù)作用，并能促進(jìn)AS斑塊的消退，因此探索與HDL-C相關(guān)的miRNAs，可為將來基因治療提供一定的思路。ABCA1和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ABCG1）是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體超家族中的一員。ABCA1主要負(fù)責(zé)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，ABCG1主要負(fù)責(zé)促進(jìn)膽固醇流出到成熟HDL上，兩者在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡中起到非常重要的作用。研究證實影響ABCA1和ABCG1的miRNAs主要有：miR-10b、miR-19b、miR-26、miR-27a/b、miR-33a/b、miR-128-1、miR-144、miR-148a、miR-302a、miR-758[25，26]。此外，B 類 I型清道夫受體（SR-B1）既介導(dǎo)細(xì)胞選擇性攝取HDL和LDL-C，同時也可以通過與HDL的相互作用，介導(dǎo)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運。與SR-B1相關(guān)的miRNAs主要有：miR-96、miR-125a/b、miR-185、miR-223、miR-455[27，28]。

2.3 miRNAs與家族性高膽固醇血癥的研究進(jìn)展

miRNAs與FH的研究起步較晚，到目前為止直接來源于FH患者的證據(jù)的文章僅有4篇。最早的miRNAs和FH相關(guān)的研究是2011年美國馬里蘭大學(xué)的團隊采取FH患者的血液提取HDL，檢測其中的miRNAs并與正常人的進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)明顯上升的是miR-223、miR-105和miR-106a，隨后在高脂喂養(yǎng)的LdLr-/-小鼠中證實了miR-223顯著升高[29]；2014年上海交通大學(xué)團隊發(fā)表論文顯示，他們采用U133 2.0芯片對6例雜合FH患者和12例正常人進(jìn)行檢測，最后圍繞五個主要的轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)的miRNAs繪制了交叉反應(yīng)圖譜，里面有很多和LDL-C代謝相關(guān)的miRNAs， 如：miR-27a/b，miR-130b，miR-185 等[30]；隨 后2015年來自意大利團隊為探討miR-33a和miR-33b與FH兒童的相關(guān)性，收集了28例FH兒童和25例正常兒童進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個miRNAs在FH兒童中顯著升高，并與總膽固醇（TC）、LDL-C、ApoB及C反應(yīng)蛋白正相關(guān)，揭示了miR-33a和miR-33b可作為FH兒童時期的早期生物標(biāo)志物[31]；2017年西班牙團隊采用含30個與血管平滑肌細(xì)胞生理和病理生理相關(guān)的miRNAs芯片，分別對心臟移植患者的動脈平滑肌細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞系等進(jìn)行篩選，再到FH患者中進(jìn)行驗證，最后發(fā)現(xiàn)miR-24-3p和miR-130a-3p在FH患者中明顯降低，隨后作者又在50例CHD患者中進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)循環(huán)中miR-130a-3p和CHD顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-130a-3p可作為FH發(fā)生CHD的早期生物標(biāo)志物[32]。

圖1 可能與家族性高膽固醇血癥相關(guān)的miRNAs匯總圖

在動物實驗中，Martins等[33]采用聯(lián)合miRNA沉默的三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶以及轉(zhuǎn)基因LDLR質(zhì)粒的方法，構(gòu)建pLDLR-LDLR-miR82融合質(zhì)粒，采用水流動力學(xué)注射到LdLr-/-小鼠的肝臟，不僅可降低39%的LDL-C水平，還可有效延緩AS的進(jìn)展，治療12周后也無明顯肝功能異常及肝臟膽固醇聚積等不良反應(yīng)。

3 miRNA治療新進(jìn)展

近來，美國食品藥品管理局審批了ApoB的反義寡核苷酸——米泊美生（mipomersen）用于治療HoFH[34]；新型長效PCSK9靶向RNAi治療性抑制劑（inclisiran， ALN-PCSsc）也完成了510例心血管疾病高危患者的Ⅱ期多中心臨床試驗，結(jié)果顯示在第1天和第90天分別使用300 mg的劑量，48%的患者在6個月后的LDL-C水平低于50 mg/dl，并且LDL-C水平可持續(xù)降低至8個月[35]；以上研究對于FH的新型治療提供了新思路。然而反義寡核苷酸與miRNA相關(guān)的治療存在如下問題：（1）與內(nèi)源性miRNAs的生物合成相互競爭；（2）晚期干擾素應(yīng)答反應(yīng)等；（3）脫靶效應(yīng)[36]。而miRNAs可有效避免上述問題，因此miRNAs有望成為新的治療手段。目前正在進(jìn)行臨床研究的有兩個miRNAs：miR-122和miR-34。第一個藥名是miravirsen，是專門抑制miR-122的鎖核酸修飾的硫代反義寡核苷酸，來自加拿大的研究者在7個國際中心對miravirsen用于36例慢性丙肝感染的有效性和安全性進(jìn)行了評估，隨機分組后隨訪18周發(fā)現(xiàn)miravirsen用于慢性丙肝1型感染患者表現(xiàn)出長期劑量依賴性地減少丙肝病毒RNA水平，且未出現(xiàn)病毒抵抗性[37]；另一個臨床試驗的是MRX34——miR-34的雙鏈miRNA模擬物，可通過抑制多個抑癌基因的通路以及刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)從而達(dá)到抑制腫瘤的作用。研究者對47例晚期實體腫瘤的患者進(jìn)行每周兩次的靜脈注射MRX34，證實在這些患者中可安全耐受，且對于非原發(fā)性肝癌的患者來說，最大耐受劑量為110 mg/m2[38]。但是，目前把miRNAs治療廣泛用于臨床還有一些問題需要解決：（1）載體問題?？偹苤Ｒ?guī)使用的慢病毒、腺病毒等病毒載體存在免疫原性，細(xì)胞毒性，甚至有促癌風(fēng)險，而非病毒載體如脂質(zhì)體和納米材料等，同樣存在無法細(xì)胞特異性輸送的問題；（2）miRNAs的多效性。由于miRNAs存在生物學(xué)多效性，而大多數(shù)體內(nèi)研究僅是針對某個特定的器官進(jìn)行的觀察，缺乏整體的探討，是否除了靶基因治療之外還存在其他的作用，值得深入探討。綜上所述，miRNAs的臨床治療已經(jīng)開展，從目前的試驗結(jié)果看，miRNAs具有一定的臨床應(yīng)用價值，然而在AS或是CHD的治療領(lǐng)域，將來還需要更多的研究加以證實其有效性和安全性。

我國新近研究表明，中國FH的人群患病率為0.31%，在CHD患者中更高，達(dá)到3.9%[39，40]。因此，應(yīng)一方面大力宣傳FH，增加患者和醫(yī)生對該病的認(rèn)識程度；一方面提倡早期篩查早期治療FH；另一方面應(yīng)探尋新的FH治療方式，以減少FH疾病所帶來的巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。隨著科技快速發(fā)展，新型技術(shù)的開展把醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了一場全新的革命，而轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的興起為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究指明了新的方向。隨著miRNAs研究的不斷深入，新技術(shù)的不斷發(fā)展，我們期待新型的miRNAs治療能成為FH患者的有效治療藥物之一，能使這些患者的LDL-C水平真正達(dá)到指南要求的目標(biāo)值，從而延緩AS的進(jìn)展，最終延長患者生命。